Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Новые подвижные фазы для формирования внутренних градиентов pH в катионообменных системах : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.02

Год: 2006

Номер работы: 49488

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Введение Актуальность работы. Ионообменная и комплексообразовательная хроматография находят все большее применение в аналитической химии за счет расширения модификаций круга определяемых вариантов соединений жидкостной и появления все новых из данных хроматографии. Одним важнейших параметров, позволяющих повышать селективность разделения, является рН подвижной фазы. Часто в хроматографии используют градиентное элюирование, т.е. изменяют состав элюента по определенному правилу. Так, в

нм) из-за высокого фонового поглощения компонентов подвижных фаз. Поиск простых элюентов, позволяющих регистрировать сигнал пептидов при 214 нм, является очень важной задачей при анализе гидролизатов белков. Цель и задачи исследования. • Изучение кислотно-основных и комплексообразующих свойств карбоксильных сорбентов. Определение селективности данных сорбентов по отношению к ионам переходных металлов в зависимости от рН в статических условиях. • Формирование внутренних, нисходящих и восходящи

Разделение цвиттер-ионных (биполярных) макромолекул, например, белков, в ХФ основано на различии их изоэлектрических точек (р/) [37]. Для этого используют ионообменный сорбент, обычно с анионообменными свойствами, который обладает достаточно вьюокой буферной емкостью в широком диапазоне рН, благодаря наличию ионогенных групп. Исследуемую смесь белков растворяют в том же буферном растворе, которым уравновешивают сорбент, и наносят на колонку в первых порциях элюента. Все белки пробы одновреме

В 1990-х гг. появились первые публикации об использовании градиентного элюирования для разделения смесей неорганических веществ. Нестеренко и Иванов впервые применили элюирование с внутренним линейным градиентом рН для разделения смеси 3-5 ионов переходных металлов на хелатообразующем сорбенте [17]. В основу метода положена способность ионов переходных металлов удерживаться в хроматог|:>афической колонке за счет комплексообразования с аминогруппами последующим при исходно более высоких зн

Помимо обычных требований, предъявляемых к сорбентам в ионообменной хроматографии: • • • • низкого сопротивления массообмену; отсутствия набухания в органических растворителях и воде; наличие развитой удельной поверхности; стабильности свойств сорбентов (например, несмываемость элюентов в стационарной фазы при использовании различных широком интервале

рН) и некоторых других, для сорбентов в ХФ существует ряд специальных требований. К ионообменникам не предъявляются особенно жесткие

. Сорбенты на основе органополимерных матриц устойчивы в широком диапазоне рН 1-11, но они набухают в воде, подвергаются воздействию микроорганизмов (особенно в случае с полисахаридной матрицей); их частицы менее устойчивы при вьюоких давлениях, что ограничивает применение таких сорбентов в системах с высоким рабочим давлением. В качестве матрицы для сорбентов применяют сефадекс, представляющий собой полисахаридные для декстрановые цепи, поперечно сшитые между собой цианурхлоридом получен

. Основное требование к сорбентам в ХФ - наличие набора ионообменных функциональных групп с различающимися значениями рКь или рКа, обусловливающего постоянство буферной емкости в широком интервале рН. Это, конечно, относится к слабым ионообменникам. В случае сильных ионообменных сорбентов основную роль при формировании градиента рН играют буферные свойства подвижной фазы. В ХФ применяют полии монофункциональные сорбенты, анионообменные и монофункциональные катионообменные обладающие пост

Как уже упоминалось выше, изначально метод ХФ разрабатывали для анионообменных колонок, в которых формировали нисходящий градиент рН [20, 23]. Это, в первую очередь, связано с объектами разделения характерными для данного метода: белками, полипептидами, аминокислотами при высоких и другими рН на цвиттерионными соединениями. Цвиттер-ионы значениях заряжены отрицательно, а при низких - положительно. Следовательно, анионообменный сорбент они будут сорбироваться при высоких значениях рН, а п

Катионообменным сорбентам исследователи уделяли мало внимания, и такого рода сорбенты специально для метода ХФ фирмами не производились. В связи с этим в литературе редко встречаются работы, в которых используются катионообменные сорбенты для получения восходящих градиентов рН. Хотя уже в первой работе по ХФ [20] была предпринята попытка очистки коммерческого препарата бычьего сывороточного альбумина (БСА) на препаративном сорбенте CM-Bio-Gel А (Bio-Rad Labs., Ричмонд, США). Слайтерман провел

Отдельного рассмотрения заслуживает использование метода ионообменной хроматографии (ИОХ) для разделения пептидов. К одной из первых относится работа по разделению пептидов, при использовании т.н. неудерживаемого градиента рН, формируемого внешним смешиванием буферных растворов до колонки [85]. В работе использовали катионообменную колонку Amberlite 200, и формировали линейный градиент рН смешиванием

0.1 М буферного раствора пиридина (рН

3.5) как стартового раствора, и 2 М раство

В хроматофокусировании используют две подвижные фазы - стартовый раствор и буферный элюент. Последовательно рассмотрим возможный состав и особенности этих фаз.

Стартовые ионообменника до растворы (СР) предназначены первоначального для уравновешивания рН. За счет необходимого значения правильного выбора стартового раствора и элюирующего буферного раствора можно сформировать линейный градиент в требуемом (стартового) диапазоне раствора рН. и Рекомендуемые составы уравновешивающего соответствующего буферного элюента приведены в табл. 3. 36 Таблица 3. Примеры стартовых растворов и соответствующих буферных элюентов для анионообменных систем [21,

Буферный элюент в методе ХФ формирует градиент непосредственно в колонке, взаимодействуя с ионогенными группами сорбента, в отличие от методов получения внешних градиентов рН. Элюенты, применяемые в ХФ, должны отвечать следующим требованиям: обладать высокой буферной емкостью, постоянной в широком интервале рН, требуемом для создания градиента; не взаимодействовать с разделяемыми компонентами пробы (например, не образовывать пептидные связи с белками) [26, 96]; не затруднять детектирование и

Ионогенные (кислотные и основные) группы полиамфолитов подобраны таким образом, чтобы их значения р/Сд и p/C/j равномерно перекрывали интервал рН от 2-3 до 10-11, что позволяет добиться линейного градиента рН при пропускании элюента через хроматографическую колонку. Основные группы в составе полибуферных элюентов представлены первичными, вторичными, реже третичными группами и аминогруппами; кислотные остатками сульфокислот, - гидроксильными, карбоксильными реже фосфоновых кислот. Непосредст

2.2. Многокомпонентные буферные смеси Несмотря преимуществом на все недостатки являлась полибуферных возможность элюентов, главным плавных последних формирования линейных градиентов в широком диапазоне рН. В стремлении воспроизвести свойства полибуферов, но отказаться от полимерной природы элюентов, были предложены многокомпонентные смеси (20-30 компонентов) низкомолекулярных протолитов и амфолитов. Т.е. подбирались слабые кислоты, основания и биполярные соединения таким образом, чтобы зн

Большинство работ по ХФ являются сугубо прикладными, в них не ставятся задачи развития и изучения метода. Авторы решают локальные задачи, эмпирически подбирая оптимальные условия разделения. Причем, подобные работы на 99% связаны с практическим применением для анализа биохимических объектов и, соответственно, охватывают лишь некоторую часть возможностей элюирования с градиентом рН. Но, в целом, все ставят перед собой схожие задачи - получить плавный, линейный градиент в определенном диапазон

(Модель «буферных взаимодействий» или «последовательного титрования»). Попытки создания моделей различной степени сложности для формирования градиентов рН предпринимались уже на первых этапах развития метода. Так, из модели Слайтермана и Элгерсмы [19] следует, что для получения плавного линейного градиента рН следует использовать сорбент и подвижные фазы, обладающие постоянной буферной емкостью в достаточно широком диапазоне рН. Однако модель целиком базируется на теории гомогенных равновес

(Модель «фронтального разделения») В 1985 Мурел с сотрудниками [67] отметил ограниченность описанной выше модели. Предложенная Мурелом модель может объяснить образование ступенчатых градиентов рН. Недостатки модели заключаются в том, что хотя она и учитывает гетерогенность системы, но построена на теории экстракционных равновесий и включает отношение концентраций /-ого компонента в секции колонки к его концентрации в элюенте, не поддающееся экспериментальному определению. С помощью модели Му

(Модель «локальных равновесий», LEQ) Наиболее адекватную физико-химическую модель разработал Фрей с соавторами [11, 12, 66, 95, 101, 84-91]. Модель Фрея учитывает: • кислотно-основные равновесия, протекающие в жидкой и твердой фазах; • изменение адсорбционной емкости сорбента, содержащего слабые кислотные и слабоосновные функциональные группы, с изменением рН; • • процессы анионного обмена на функциональных группах сорбента; массоперенос в системе, в том числе и диффузионные процессы в порах

(Ионообменная динамическая модель) Тессманом и сотр. на кафедре аналитической химии МГУ была предложена физико-химическая модель, которая с помощью компьютерного моделирования позволила предсказывать не только общую форму градиентов рН, но и влияние ионной силы подвижных фаз на профиль внутреннего градиента рН и появление «аномальных» участков [111-115]. Модель учитывает совокупность гетерогенных и гомогенных равновесий, протекающих в системе. При этом основное внимание уделялось пониманию 46

. Компьютерные эксперименты показали, что при определенном соотношении сильного электролита в подвижных фазах происходит сглаживание некоторых участков градиента рН. Так, при пропускании через колонку со слабоосновным анионообменником (предварительно уравновешенную стартовым раствором) элюента простейшего состава, содержащего только NaCI и один активный (рН-определяющий) компонент в форме одноосновной кислоты НА, на выходной кривой эффлюента наблюдаются два фронта. На рис. 10 приведен ряд гр

. Нестеренко с сотр. [114, 115] связывает появление "аномального подъема" на начальном участке градиента рН либо с высокой ионной силой элюента, либо с присутствием слабого основания в составе подвижных фаз. Для подтверждения данной гипотезы Тессман и Иванов [112] провели ряд экспериментов, в которых в качестве элюентов использовали гомологический ряд двухосновных кислот - щавелевую, малоновую и янтарную кислоты. Во всех случаях, кроме янтарной кислоты, на профиле градиента рН наблю

. Далее Ивановым с сотр. [116] было продемонстрировано совместное влияние ионной силы и слабого основания в подвижных фазах на начальный участок градиента рН. На рис. 17 (кривые 1-3) представлены градиенты рН, полученные при различной ионной силе элюента, создаваемой NaCI. При /э ~0,5 на профиле градиента рН наблюдается два участка с увеличением рН (кривая 1). Авторы объясняют это тем, что при пропускании элюента сначала происходит дополнительное протонирование сорбента со связыванием оксала

. Руководствуясь собственными рекомендациями, Иванов и сотр. [102] разделили модельную смесь аминокислот, используя элюент простейшего состава (рис. 18). 1 - Syslern 2 - Pro (pi - 6, 3 - Туг (pi - S. 4 - Phe (pi - 5,48) Ir, 40 V, мл Рис. 18. Хроматограмма модельной смеси аминокислот и профиль внутреннегс градиента рН для системы СР: 25 мМ Трис-НС1, рН=7,5, /|масг

0.02 М, Элюент: 2мМ щавелевая к-та, 1 мл/мин. Колонка: 50x

4.6 мм, Tetr6n-SiO2,

7.5 мкм [102]. Хроматографичес

Глава 4. Аппаратура, реагенты, методики экспериментов.

Для формирования градиентов рН с применением «классической» техники хроматофокусирования использовали хроматографические системы низкого и высокого давления. Хроматографическая система низкого давления (схема

6) включала в себя: насос ХПЖ-1 (г. Дзержинск, Россия) (7); стеклянную хроматографическую колонку К9/30 (300x9 мм), заполненную карбоксильным катионообменным сорбентом (2); систему для регистрации рН (3), включающую самодельную проточную ячейку [126], цифровой рН-метр "ТОА El

. Сорбенты следующие и хроматографические колонки. В работе сорбенты использовали (табл. 5). катионообменные карбоксильные Хроматографические колонки для ВЭЖХ заполняли суспензионным способом из смеси изопропанол-вода с предварительной обработкой на ультразвуковой бане. Стеклянную колонку 300x9 мм заполняли суспензионным способом из воды, с предварительной ультразвуковой обработкой сорбента и удалением микрочастиц декантацией. Таблица 5. Характеристики изученных карбоксильных сорбентов Со

. Формирование внутренних градиентов рН. Хроматографическую колонку уравновешивали стартовым буферным раствором до значения рН, соответствующего начальной точке градиента, затем пропускали элюент со значением рН, соответствующим конечной точке градиента. Кислотность эффлюента контролировали в проточной микроячейке и регистрировали сигнал цифрового рН-метра с помощью самописца или в некоторых случаях через АЦП с помощью компьютера и программы "Экохром" (ИОХ, Россия). При разделении

Глава 5. Свойства карбоксильных сорбентов.

. Катионообменные сорбенты на основе кремнеземов и органических полимерных матриц с привитыми карбоксильными группами все шире применяют для концентрирования и разделения ионов металлов [56, 109-112]. Интерес к карбоксильным катионообменникам вызван сочетанием ионообменных свойств по отношению к щелочным с и щелочноземельным металлам и возможного комплексообразования переходными металлами. Комплексообразующие свойства привитых карбоксильных групп существенно зависят от кислотности конт

. При оценке буферных свойств ионообменников для хроматофокусирования было проведено кислотно-основное уравновешенных титрование или навесок щелочью, сорбентов, построены предварительно кислотой дифференциальные кривые в координатах "ApH/AV - рН" и найдены интервалы рН с практически постоянной буферной емкостью. Очевидно, что градиенты рН, получаемые в колонке с изучаемым ионообменником с применением техники хроматофокусирования, будут наиболее линейными и плавными именно в этом

5.3. Комплексообразующие свойства СМ-52. Наличие карбоксильных групп говорит о комплексообразующих свойствах данного сорбента по отношении по к ионам ионам металлов металлов. определяют Емкость как в комплексообразующих сорбентов динамическом, так и в статическом режимах, причем результаты, полученные в обоих вариантах при использовании подвижных фаз одинаковой природы, практически совпадают [43]. Предпочтение было отдано статическому варианту определения емкости сорбента. Сорбцию меди, к

, В таблице 5 (с.

62) приведены характеристики изученных сорбентов. Для сорбента MN на основе сверхсшитого полистирола титрование не проводили, а данные по ионообменной емкости взяты на основании сравнения градиентов рН, полученных для всех сорбентов в одинаковых условиях. При этом на сорбенте MN градиенты получаются наименее протяженными, что свидетельствует о меньшей емкости данного сорбента. Интервалы рН с постоянной буферной емкостью у изученных карбоксильных сорбентов практически

. Известно, что в случае аминосодержащих анионообменников сорбция достигает максимума для ионов меди через 1 0 - 2 0 мин., а для кинетически инертных ионов Ni^"^ и Со^'^ - через 20 - 30 мин. [39, 56, 130]. Вероятно, такое продолжительное время установления равновесия связано и с многоступенчатым образованием олигоэтиленаминных комплексов, поэтому можно ожидать, что одностадийное комплексообразование с карбоксильными группами будет происходить быстрее [131]. Ион Ni^'^ выбрали в качестве

. При изучении сорбции с увеличением рН раствора наблюдали окрашивание сорбента: в случае меди - в синий цвет, в случае кобальта - в розовый, в случае никеля - в зеленый, причем окраска становилась более интенсивной по мере увеличения рН. Это служит косвенным подтверждением сорбции металлов по механизму комплексообразования с функциональными карбоксильными группами 75 на поверхности сорбента. Следует также отметить, что для случая матриц с привитыми олигоэтиленаминными группами окраска сорбен

. Сорбционная емкость является одной из важнейших характеристик комплексообразующего сорбента при использовании его для определения и разделения металлов методом хроматофокусирования. Она пропорциональна содержанию функциональных групп на поверхности комплексообразующего сорбента. Однако эта зависимость далеко не всегда линейна из-за неоднозначности протекания реакции и из-за того, что не все функциональные группы доступны для комплексообразования [56]. В динамическом варианте емкость сорбент

. Характеристикой селективности сорбента по отношению к ионам металлов служат значения рН 50%-ой сорбции (pHso) [123]. Из табл. 11 видно, что для Ольвагель-СООН значения рНбо лежат в широком интервале

2.0

6.0, распределены достаточно равномерно, и только в случае ионов Мп^"^ и Zn^'*' отличаются между собой на

0.1 ед. рН. Таблица 11. Значения рН 50%-ной сорбции ионов карбоксильных сорбентах Ольвагель-СООН и СМ-52. переходных СМ-52 металлов на Ион Ni'^ Со^^ РЬ'^ М

5.4.5. Извлечение ионов Си^^ в зависимости от рН. Сравнение катионообменников СМ-52, Ольвагель-СООН, MN и Масго-Ргер 50 СМ проводили по извлечению ионов Си^* в зависимости от рН раствора. Из рис. 26 видно, что для сорбентов Ольвагель-СООН, MN и Масго-Ргер 50 СМ графики похожи: при рН 4,5 - 5,0 наступает десорбция ионов Cu^'^, тогда как на сорбенте СМ-52 ионы меди продолжают сорбироваться и при рН 2. тогда как СМ-52 целесообразнее применять для группового Сорбция, % 100 80 60 40 20 3 5 7 8рН

Глава 6. Нисходящие градиенты рН в хроматофокусировании.

. Выбор подвижных фаз основан на имеющихся у нас данных по нисходящим градиентам рН для анионообменных сорбентов. При формировании нисходящих градиентов в области рН

7.5 -

3.0 внутри анионообменных колонок в качестве стартовых обычно используют растворы слабых оснований - Трис или гистидина. Отметил/!, что при разделении переходных металлов предпочтительнее уравновешивать колонку раствором Трис, поскольку гистидин более склонен к связыванию ионов металлов в комплексы, что может о

. При уравновешивании катионообменной карбоксильной колонки 10 мМ раствором Трис-НС1 (рН

7.5, I =

0.1) происходит сорбция протонированной формы Трис на депротонированных карбоксильных группах катионообменника (схема 9). Уравновешивание Элюирование Подъем рН "COOH 'COOH НД —COO'HJNK •"COOH + A-COO'HjNR'*' + \ \i—COOH \,|—COOH RNH/CIM^C' -COO'Na+ HA -COOH •соо'н,мя \ -COOH Схема 9. Процессы, протекающие в колонке: 1 - уравновешивание (X'' - противоион, оставшийся

. Интересно отметить, что замена одного стартового раствора на раствор иной природы практически не влияет на профиль градиента рН, а влияние ионной силы при этом сохраняется. Так, при использовании буферного раствора в качестве стартового, сохранив 10 мМ фосфатного остальные условия эксперимента (т.е. рН и значение ионной силы подвижных фаз, концентрацию элюента), получили градиенты, полностью идентичные представленным на рис. 27. В данном случае одинаково вьюокая ионная сила в фосфатном ста

. В качестве элюентов, формирующих градиент рН внутри колонки, мы выбрали растворы карбоновых кислот с увеличивающимся числом карбоксильных групп - уксусной {pKs

4.76), щавелевой (р/<а

1.25 и

4.27), винной (р/<а

2.98 и

4.34) и лимонной (р/Са

3.10,

4.76 и

6.40). Концентрации кислот варьировали в интервале 87 от 5 до

0.2 (в отдельных случаях - до

0.05) мМ. Для изученных кислот профиль нисходящего градиента рН можно разделить на н

. Как отмечалось выше, в случае, если ионная сила стартового раствора выше, чем элюента, тс на начальном участке градиента рН наблюдали подъем выше значения рН стартового раствора. От этого эффекта можно избавиться повышением ионной силы элюента. Так, при относительно высокой ионной силе в элюенте и стартовом растворе удается получить достаточно плавный градиент рН без подъема на начальном участке, зато с более протяженным квазилинейным участком (рис. 33, кривая 3; таблица 13). 20 60 100 14

. В препаративном варианте хроматографии на катионообменной колонке Масгоргер 50 СМ показали возможность разделения катионов металлов переходных в условиях нисходящего градиента рН (рис. 36), полученного с использованием однокомпонентного элюента. 96 рН с О" ' V. мл Рис. 36. Разделение ионов переходных металлов методом ХФ при использовании однокомпонентного элюента. Колонка: 50x

4.6 мм, МасгоРгер 50 СМ; стартовый раствор: 10 мМ Трис-НС1, рН

7.50; элюент:

0.5 мМ ли

. Чтобы проверить существование солевого градиента (градиента ионной силы) при формировании градиента рН, в потоке измеряли концентрацию компонентов сильного электролита на выходе из колонки в процессе формирования градиента рН при одинаковых стартовом растворе и элюенте, но с разной ионной силой. В качестве регистрируемого выбрали нитрат-ион, т.к. ионселективный электрод на данный ион оказался наиболее доступным и имеющим линейную электродную функцию в достаточно широком диапазоне концентра

Глава 7. Индуцированные нисходящие градиенты рН. Кроме техники классического хроматофокусирования, для формирования внутренних градиентов рН, существует техника индуцирования [43, 64, 117]. В этом случае через колонку постоянно пропускают элюент при низком значении рН (3-4), затем вводят небольшой объем (~1

мл) концентрированного индуцирующего раствора при более высоком рН (выше 9). При этом система быстро переуравновешивается, и на выходе из колонки наблюдается резкое изменение рН. Да

. Как уже говорилось выше, актуален переход от традиционно используемых в хроматофокусировании синтетических полиамфолитных элюентов - Polybuffer 96, Polybuffer 74 - к более простым и дешевым смесям низкомолекулярных амфолитов или протолитов [66, 111]. Удается сократить число активных компонентов элюента до 2-3 в технике индуцирования, и до 1-2 - при высокой ионной силе - в технике хроматофокусирования [43]. В данной работе решили использовать простейшие двухкомпонентные буферные понять прир

7.1.1. Влияние концентрации ИР. При получении градиентов рН с использованием техники индуцирования существует принципиальное отличие от «классического» хроматофокусирования. 104 Одна из подвижных фаз (ИР) пребывает в колонке очень короткое время, хотя и успевает за счет своей высокой концентрации переуравновесить систему, но, возможно, эти особенности могут изменить закономерности, которые были справедливы для «классического» варианта. Высокая концентрация ИР по сравнению с элюентом (отлич

. На данном этапе работы изменяли концентрацию кислоты в составе элюента при постоянной концентрации индуцирующего раствора. к I, мин А: Элюент: 1 -15 мМ лимонная к-та ^- Трис (рН 4 •0); 2-- 2 мМ лимонная к-та + Трис (рН

4.0). HF':

0.5 М NHs. Рис. 43. Влияние концентрации органической рН, Скорость: 1 мл/мин. t, у ин Б: Элюент: 1 - -8 мМ уксусная к-та (1 =

0.1) (рН 3

5); 2- - 5 мМ уксусная к-та (1 =

0.1) (рН

3.5). ИР :

3.25 М NH3(1 =

0.1), к

. Если исходить из механизма «буферного действия» [67-69], то более плавные градиенты должны получаться в случае элюентов состоящих из компонентов, рК которых равномерно покрывают выбранный диапазон рН. Поэтому элюент должен представлять из себя буферный раствор, включающий кислоты и основания с разнообразными рК. Природа слабого основания, добавляемого градиента рН. в элюент, вероятно, может оказывать влияние на профиль

9.5 Рис. 44. Влияние природы основания в составе элюента на профи

. Для исследования влияния природы элюента на профиль нисходящего градиента рН при применении техники индуцирования использовали органические кислоты - лимонную и уксусную с добавками аминогексановой. Начальный участок снижения рН в случае уксусной кислоты примерно в три раза протяженнее, вероятно, потому что уксусная кислота - одноосновная и более слабая (рКа

4.76) (рис. 45). Конечное значение рН для градиента с использованием лимонной кислоты ниже, чем для уксусной, но снижение рН в

. На первом этапе градиент рН индуцировали

3.25 М раствором ЫНз, т.к. ранее подобные индуцирующие растворы уже были использованы в анионообменных системах. На рис. 46 показано влияние сильного электролита (NaCi) в элюенте и индуцирующем растворе на профиль нисходящего градиента рН. 30 50 t, мин Рис. 46. Влияние сильного электролита в подвижных фазах на профиль градиента рН. Э:

-8мМСНзСООН; c(NaCl), М: f, 3 - 0 . 1 ; 2 - 0. ИР:

-

3.25 М ЫНз, с (NaCI), М: 7 - 1 ; 2,

. Так как мы имеем дело с катионообменным сорбентом, то нельзя пренебрегать влиянием природы катиона в составе электролита, создающего ионную силу в подвижных фазах на профиль индуцированного градиента рН. рН 20 40 t, мин Рис. 47. Влияние природы катиона сильного электролита в составе элюента на профиль градиента рН. Э: 5 мМ уксусная кислота +

0.1 М NaNOs (1);

0.1 М CsNOs (2);

0.1 М LiNOs (3);

0.1 М KNOa (4) ИР:

3.25 М NH3. Скорость: 1 мл/мин. В ряду катионов N

. Чтобы упростить понимание процессов, протекающих в колонке, уменьшили число компонентов различной природы в системе. Поэтому в дальнейшем перешли к индуцирующим растворам на основе СНзСООМа, т.е. к ацетатной системе в целом.

11.5 Рис, 49. Профиль нисходящего градиента рН при индуцировании в ацетатной системе. Э:

-5мМСНзСООН;с(ЫаС1), М: f, 2-0; 3 - 0 . 1 . ИР:

- 4 М СНзСООЫа; c(NaCI), М: 1-0,2,3-1. Остальные условия в тексте. В случае с ацетатной системой (рис.

49) р

. Изучив влияние различных компонентов системы на профиль нисходящего градиента рН при применении техники индуцирования, мы выбрали условия для разделения модельной смеси ионов металлов. Металлы для приготовления модельной смеси отбирали, исходя из значений рН, при которых наблюдали десорбцию этих ионов при исследовании в изократическом режиме. Готовили элюенты на основе 5 мМ уксусной кислоты при различных значениях рН (от 3 до б с интервалом

0.5 ед. рН), создавая необходимую кислотност

. Выбор подвижных фаз в данном случае мало отличается от классического варианта хроматофокусирования на анионообменных сорбентах. При формировании восходящих градиентов также используются элюенты на основе коммерческих полибуферов (Polybuffer, Pharmalyte, Buffalyte и т.п.) [12, 13, 59], а в стартовых растворах слабые основания заменяют на слабые органические кислоты (из-за низкого значения рН начальной области градиента). Мы решили 119 рассмотреть ряд карбоновых кислот - уксусную, щавелевую,

. Чтобы улучшить форму градиента, т.е. приблизить к квази-линейной, попробовали использовать стартовые растворы различной природы. рн 7,5

6.5

5.5 40 80 120 t, мин Рис. 53. Влияние природы стартового раствора на профиль восходящего градиента рН. СР: 1 -

12.5 мМ уксусная кислота + HCI (рН

3.0), 2 - 2 мМ лимонная (рН

2.95), 3, 4-2мМ щавелевая (рН

2.4), 2 мМ винная (рН

2.9); Элюент:

12.5 мМ Трис + HCI (рН

7.6). Остальные условия такие же как

. Данная форма градиентов, вероятно, обусловлена в первую очередь тем, что в интервал формируемого градиента рН у компонентов элюента (Трио, рКа

8.1) не попадают их рК, и, следовательно, элюент почти не проявляет буферных свойств в этом диапазоне рН. Решением данной проблемы будет добавление в элюент компонентов с рК, попадающими в область рН от 3 до 7. Для этих целей хорошо подходит лимонная кислота (рКа

3.1,

4.76,

6.4). рН 80 120 t, мин Рис. 55. Влияние добавок лимо

. Такое значительное влияние добавок лимонной кислоты в элюент на профиль градиента рН навело нас на мысль попробовать добавить в стартовый раствор слабое основание Трис. Тем более, что подобный подход уже ранее нами применялся для анионообменных систем, где в качестве стартового раствора использовали 25 мМ Трис + 10 мМ Н2С2О4, а элюентом служила буферная смесь 20 мМ Н2С2О4 +

22.5 мМ Трис [111]. V, мл Рис. 57. Влияние добавок Трис в стартовый раствор на профиль восходящего градиента р

. Как мы уже отмечали выше, для слабых анионообменных сорбентов ионная сила подвижных фаз играет важную роль в первую очередь из-за того, что на поверхности сорбента имеется набор различных аминогрупп (первичных, вторичных, третичных) с разными значениями рК. При изменении ионной силы в пропускаемом растворе изменяются и условные константы протонирования данных групп, поэтому такого рода сорбенты проявляют буферные свойства в гораздо более широком диапазоне рН, чем можно было бы ожидать. Так

. Для подтверждения данного тезиса разделили модельную смесь 2-х белков (рис.

60) с близкими значениями изоэлектрических точек: овальбумин (р1

4.7) и бычий сывороточный альбумин (р1

4.9) [12]. А, 280 нм ^ 1

0.25 и очистки биологических макромолекул (например, белков и

2.5 О 20 40 V, мл Рис. 60. Разделение модельной смеси, содержащей по

0.02 мг овальбумина (Oval.) и бычьего сывороточного альбумина (BSA). СР: 2 мМ лимонная кислота +

1.5 мМ Трис (р

. При добавлении сильного электролита в стартовый раствор значительно изменяется угол наклона на 3-м участке градиента и несколько сглаживается первый участок, на котором в данном случае не наблюдается уменьшения рН ниже рН стартового раствора (рис. 61, кривая 1). рН

6.5 4,5 2,5 20 40 60 80 t, мин Рис. 61, Влияние ионной силы стартового раствора на профиль восходящего градиента рН. СР: 2 мМ лимонная кислота +

1.5 мМ Трис (рН

3.3); Элюент: 20 мМ Трис + 5 мМ лимонная кислот

.

. Было интересно изучить влияние ионной силы подвижных фаз на профиль градиентов рН, полученных на карбоксильном сорбенте с малым размером частиц (5 мкм) и небольшой ионообменной емкостью (табл. 5, с. 62). Т.к. мы уже изучили сорбционные свойства сорбента MN на основе сверхсшитого полистирола (ССПС) с привитыми карбоксильными группами, то именно он и был выбран на данной стадии исследования. Выбор подвижных фаз был сделан на основе имеющегося опыта по формированию восходящих градиентов рН на

. Мы провели хроматофокусирование образца формиат дегидрогеназы (ФДГ), используя градиент рН, полученный при создании высокой ионной силы в стартовом растворе (рис. 65). рН А, 280 нм

0.12 15 25 V, мл Рис. 65. Хроматофокусирование образца ФДГ с восходящим градиентом рН. СР: 2 мМ лимонная кислота +

0.05 М NaCI (рН

3.0); Элюент: 10 мМ Трис + лимонная кислота (рН

7.5). Остальные условия такие же как на рис. 62. Полученные пики соответствуют скорее всего двум изоформам да

. Канг и Фрей предложили вариант хроматофокусирования на сильных катионообменных колонках с восходящим градиентом рН [13]. В этой работе они привели примеры разделения смесей белков и трипсиновых олигопептидов при использовании полибуферного элюента. Мы решили изучить схожую систему, формируя градиент рН с помощью простых двухкомпонентных элюентов.

. Интересно было посмотреть, оказывает ли влияние ионная сила элюента на профиль градиента рН, полученного на сильном катионообменнике. Сильные ионообменные сорбенты не обладают буферной емкостью, и поэтому принято считать, что они непригодны для целей хроматофокусирования. С другой стороны, изменяя только параметры подвижной фазы, можно способствовать образованию градиентов рН разной формы. Для изучения данного эффекта мы использовали коммерческую сульфо-катионообменную колонку Hamilton PRPХ

. Восходящие градиенты рН, формируемые внутри сильной катионообменной колонки Hamilton PRP-X200 с помощью простых элюентов, мы решили использовать для разделения многокомпонентных смесей пептидов, причем важным отличием от уже известных вариантов разделения пептидов методом хроматофокусирования являлась возможность УФ детектирования при длинах волн, близких к 200 нм, где поглощает пептидная связь. Такой подход позволяет детектировать все пептиды, а не только, например, ароматические при 280

2.1 Выбор подвижных фаз. Изученную систему с подвижными фазами на основе лимонной кислоты и Трис мы попытались белка применить для разделения пептидов, полученных (ЧСА). трипсинолизом человеческого сывороточного альбумина Оказалось, что при 214 нм поглощение подвижных фаз достаточно велико и не позволяет детектировать большинство пептидов. На хроматограммах наблюдали только достаточно сильный сигнал при мертвом объеме системы. Переход к подвижным фазам, содержащим NaH2PO4 в качестве осн

. Затем создавали условия, при которых пептиды должны значительно слабее удерживаться на колонке (или не удерживаться совсем) - добавляли в подвижную фазу сильный электролит -

0.5 М KCI. На хроматограмме можно выделить шесть пиков, причем сигнал примерно на порядок больше, чем в первом случае (рис. 68).

0.8 ^'^^""

0.6

0.4

0.2 15 25 30 V, мл Рис. 68. Хроматограмма трипсинового гидролизата

0.1 мг ЧСА в условиях слабого удерживания пептидов на кол

. Помимо ионной силы подвижных фаз на разделение пептидов может оказывать влияние добавление органического растворителя, например, ацетонитрила. Ацетонитрил в составе элюента уменьшает вклад гидрофобных взаимодействий ароматических пептидов с матрицей сорбента, если таковые имеют место. Поэтому далее проводили ХФ того же образца, но пробу вводили во время пропускания стартового раствора, а чтобы пептиды удерживались на колонке, в стартовый раствор сильный электролит не добавляли. A, 214 нм

. На следующем этапе решили добавить сильный электролит в состав элюента, что должно приводить к уменьшению удерживания пептидов на сорбенте и, соответственно, сужению формы пиков сильноудерживающихся компонентов. На полученной хроматограмме (рис.

71) наблюдали набор пиков очень похожий с предыдущим случаем (рис. 70а). Но за счет присутствия сильного электролита в элюенте некоторые пики, которые ранее были разрешены, слились в один. Также в районе 13-14 мин появился острый высокий пик,

. Использование белее разбавленных стартовых растворов в сочетании с высокой ионной силой в обеих подвижных фазах и небольшими добавками ацетонитрила (10%) позволяет увеличить селективность разделения пептидов (рис. 74). Как видно из рисунка 74, создание умеренной ионной силы (

0.1) в стартовом растворе и в несколько раз большей (

0.3) в элюенте делает возможным частично разделять слабоудерживающиеся пептиды (рис. 746) и при этом регистрировать сигнал сильнозаряженных пептидов (ри