Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Получение и применение изотопомеров белков для количественного масс-спектрометрического определения белков в биологических объектах : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.02

Год: 2013

Номер работы: 1988

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Актуальность работы Определение концентрации пептидов и белков - целевых продуктов при производстве лекарственных препаратов, диагностических наборов, реагентов для биохимических исследований - является актуальной задачей. В последние годы для определения концентрации белков, помимо традиционных методов анализа, успешно используются масс-спектрометрия. Это произошло после внедрения в практику мягких методов ионизации электроспрей (ESI-MS) и матричной лазерной десорбционной ионизации (МЛДИ, M

Обзор литературы состоит из 5-ти разделов. В первом разделе приведено описание методов ионизации в масс-спектрометрии ESI и MALDI, второй раздел посвящен обзору существующих способов введения изотопной метки для к настоящему времени масс-спектрометрического определения концентрации белков. В третьем разделе: приведены возможные схемы дезамидирования остатков аспарагина и глутамина и указаны скорости его протекания в различных средах. В четвертом разделе описано строение и свойства белков с

Глава 2. Получение изотопно-модифицированных пептидов и белков для масс-спектрометрического определения их концентрации В рамках данной главы приведено описание нового способа получения изотопомеров, изменение масс-спектра в результате обмена, оптимизация условий получения изотопомеров, изучение стабильности полученных изотопомеров, а также - измерение скорости дезамидирования остатков 13 аспарагина и глутамина в условиях получения изотопомеров. Определены оптимальные соотношения аналита и

В данной главе приведены примеры использования нового способа получения изотопомеров для решения реальных биологических задач. Для определения концентрации каждого белка требуется своя методика. Описаны новые схемы определения концентрации различных белков сыворотки крови человека: альбумина, оц-антитрипсина и а2-макроглобулина, а также активности белка стрептокиназы в коммерческих лекарственных препаратах, содержащих стрептокиназу. Разработанные новые схемы в будущем могут быть применены для

По разнице масс между изотопными пиками можно определить зарядность анализируемого вещества [1-3]. Так разница между первым и вторым пиками, в изотопном распределении однозарядной молекулы, равна 1 Дальтон (Да) и, соответственно, 1/Z в Z-зарядных формах. Таким образом, рассматривая в качестве примера масс-спектр, проинсулина человека с массой

9382.53 Da, полученный с помощью ESI-MS (Рисунок

1.1), можно сказать, что он представлен 4-х, 5-и 6-и и 7-и зарядными формами. 105 000 100

Масс-спектрометрия с источником ионизации типа электроспрей наиболее популярный метод для анализа больших биомолекул и их нековалентных взаимодействий. Также, это наиболее популярный метод ионизации при объединении масс-спектрометра с хроматографом. Массспектрометрию растворимых с таким источником ионов применяют для анализа тип масс-спектрометрии может быть соединений. Этот использован с большим количеством различных растворителей и при большом диапазоне скоростей потока. Он позволяет пол

По металлическому или стеклянному капилляру со скоростью 2-5 мкл/мин проходит раствор пробы. Обычно в качестве растворителя применяют смесь воды и органического растворителя (ацетонитрил, метанол, или изопропиловый спирт), содержащую менее 1% уксусной или муравьиной кислоты. На капилляр подается напряжение 3-4 киловольта. Через капилляр пропускают нейтральный газ (обычно азот N2) для более быстрого испарения растворителя. Полное испарение растворителя и образование ионов происходит в област

Схема источника ионов типа электроспрей. Чувствительность метода электроспрей ограничена процессом перехода ионов в области высокого вакуума. Столкновения ионов в газовой фазе и отталкивание заряженных ионов существенным образом ограничивают их переход в масс-анализатор. Эффективный транспорт ионов в ранних разработках приборов обеспечивали фокусирующие линзы. Значительное улучшение перехода ионов в масс-анализатор было достигнуто за счет применения радиочастотных мультиполеи - квад

распад, _ вызванный отталкиванием испарение растворителя /*^Щ образование 'квазимолекулярнога" иона Ч> а) испарение растворителя распад, вызванный отталкиванием полевая десорбция ионов *4* б) Рисунок

Образование ионов при электроспрее,

а) Модель остаточного заряда;

б) Модель ионной десорбции. Точный механизм образования ионов в газовой фазе до сих пор является предметом активного обсуждения. На данный момент известны две модели новообразования: модель остаточного заряда (charge residue model) и модель десорбции ионов (ion desorption model) [8]. В соответствии с первой моделью (Рисунок

1.4

а)), капли уменьшаются в размере вследствие испарения растворителя, в проц

Метод МЛДИ - наиболее популярный метод для анализа белков в настоящее время. С его помощью можно проводить анализ с наиболее высокой скоростью. В отличие от электроспрея, соли не препятствуют образованию молекулярных ионов. Можно проводить анализ веществ, растворимых в любой среде. Только с помощью метода МЛДИ можно проводить масс-спектрометрию тканей и клеток (image mass spectrometry) с целью исследования метаболизма лекарств и других соединений в каждой точке клетки живого организма. При эт

(surface enhanced laser desorbtion/ionization) Технология SELDI - это комбинация метода MALDI и микрочипа, селективного к определению одного индивидуального белка. Анализ проводят на подложке, активированной определенным образом. Технология впервые была предложена в 1993-м году [13] как альтернатива лазерной десорбционной ионизации. Технология SELDI подразумевает связывание с селективным микрочипом белков или пептидов, присутствующих в сложных биопробах, таких как сыворотка, клеточные лизаты

1.2.1. Стадии пробоподготовки для масс-спектрометрического определения концентрации белков Масс-спектрометрию применяют для идентификации, определения концентрации, а также для определения структурных характеристик белков и при поиске биомаркеров. Подходы, применяющиеся в настоящее время для анализа белков, включают пробоподготовки [15]: 1. выделение целевого белка. Очистка гель хроматографией. Процедура электрофореза. Чаще всего применяют двумерный полиакриламидный гель-электрофорез (2-D PA

Соединения, имеющие идентичную химическую структуру, но разный изотопный состав называют изотопомерами. Они имеют идентичные химические свойства, а также, в большинстве случаев, - одинаковую хроматографическую и электрофоретическую подвижность. Интенсивности ионов, соответствующие соединениям, имеющим идентичную химическую структуру, но разную массу - пропорциональны их концентрациям. Более того, интенсивности изотопных распределений соответствуют теоретически рассчитанным соотношениям. Это

Среди множества способов, применяемых для получения изотопомеров можно выделить 4 основные группы [17]: 1. метаболический (SILAC); 2. химический (1СAT, iTRAQ, ICPL, NIT, TMT и другие); 3. использование 4. протеолитический.

Наиболее ранний способ введения метки - метаболический. Он подразумевает добавление аминокислот меченных изотопом С или N во время роста и деления клеток. Вначале использовали питательную среду обогащенную изотопом 15N для роста клеток бактерий [18]. Такой способ приобрел широкую популярность после появления технологии SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture), впервые представленной в 2002-м году в работе [19]. Как правило, при использовании этого способа введения метки

Химические способы введения метки подразумевают модификацию образца группировками двух типов - содержащей изотопы («тяжелая» форма) и не содержащей («легкая» форма). В общем, для белков и пептидов каждая реакционноспособная аминокислота может быть использована для присоединения изотопно-меченной группировки. При масс- спектрометрическом определении концентрации того или иного соединения проводят сравнение интенсивностей сигнала соответствующего «легкой» и «тяжелой» введения форме метки модиф

Методы «абсолютного» количественного анализа Химические и метаболические способы введения метки предполагают наличие двух или более форм - анализируемого изотопомера. • В таком случае соединения и его индивидуальных при недоступности анализируемых белков, в частности при анализе биопроб, невозможно определить абсолютную концентрацию белка, возможно только относительную. Это связано с тем, что невозможно определить правильность измеренной концентрации белка. Необходимо сравнивать с эталоном

Протеолитические способы введения метки подразумевают использование воды Н 2 О при протеолизе такими ферментами как трипсин, химотрипсин, Glu-C, Lys-C или Arg-N. Замена 0 на 0 происходит во время проведения протеолиза. При полном введении изотопа 0 в карбоксильную группу пептида при протеолизе, масса увеличивается на 4 Da. Протеолиз проводят как в обычной воде, (анализируемый образец) так и в воде Н 2 О (стандарт). Смесь протеолитических пептидов анализируемого и контрольного образца разде

Теперь несколько слов о возможности масс-спектрометрического определения концентрации соединений без применения изотопной метки. Различают два принципиально разных подхода для масс- спектрометрического определения концентрации белков: 1. определение соотношения интенсивностей сигналов, соответствующих протеолитическим пептидам одного белка; 2. соотношения интенсивностей одному сигналов после дочерних проведения ионов, анализа соответствующих LC/MS/MS. пептиду Для получения надежного ре

На основе данных источника http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ проведен анализ способов введения изотопной метки для определения концентрации белков при решении реальных биологических задач. Количество работ, в которых используют ту или иную технологию введения метки в белки в последние годы приведено в таблице

1.2. Таблица

1.2. Применение технологий введения метки для решения биологических задач в последние годы Технология SILAC ICAT iTRAQ ICPL NIT ТМТ Ферментативный способ вв

Суммируя преимущества и недостатки всех известных способов введения метки, можно сделать определенные выводы, определяющие их возможности и ограничения. Они приведены в таблице

1.3. Суммирование существующих к настоящему моменту способов введения метки приведено в обзорах [17, 32, 37]. Таблица

1.3. Сравнительный анализ известных способов масс-спектрометрического определения концентрации белков и пептидов в биологических объектах Способ введения метки Используемые технологии Недост

Остатки аспарагина и глутамина гидролизуются с образованием соответственно аспарагиновой и глутаминовой кислоты. Дезамидирование в большой степени влияет на биологические свойства белков и пептидов. Дезамидирование проходит в широком диапазоне рН. Механизм дезамидирования сильно зависит от условий [38-40]. Схема процесса дезамидирования по двум путям представлена на Рисунке

1.16. н2с-N-NH, -С N С С- н Т О R О L-Asparagiyl peptide

В) •NH3 О -с. II -с—с- н о Cyclic imide

В рамках данного раздела приведено описание белков, анализ которых проводился в работе. Для каждого белка приведена следующая информация: молекулярная масса, основные функции, концентрация в плазме крови в норме, а также при каких патологиях наблюдается отклонение концентрации от нормы. Далее приводятся основные методы анализа данного белка, перечисляются их преимущества и недостатки.

Альбумин основной белок плазмы крови. Молекулярная масса альбумина составляет порядка

66.5 кДа [41]. Концентрация альбумина в плазме крови у здорового человека - 35-50 мг/мл [42]. Функции альбумина: 1. транспорт лекарственных препаратов, различных гормонов и жирных кислот [43, 44], а также - билирубина [45]; 2. регуляция онкотического давления. При содержании альбумина ниже 30 мг/мл онкотическое давление уменьшается настолько, что вода переходит из внутриво внесосудистый сектор [46]; 3

а 1-антитрипсин (о^-АТ, а г Р 1 , арИП, А1-АИ) - гликопротеид массой 52 кДа. Относится к ряду ингибиторов сериновых протеаз (serin proteinase inhibitor - serpin). Универсальный ингибитор протеаз в плазме крови. Ингибирует широкий ряд протеаз. Концентрация белка в плазме крови -

1.5

3.5 мг/мл. (Обычно - 2 мг/мл) [63]. При воспалении в острой фазе концентрация а г А Т резко возрастает [64]. Также повышенная концентрация ои-АТ наблюдается при возникновении злокачественных опухолей [6

оц-АТ универсальный ингибитор протеаз состоит из 418 аминокислотных остатков (

46.7 кДа), в то время как сам ai-антитрипсин это фрагмент ai-AT 25-418 массой

44.3 кДа. Имеет всего 1 остаток цистеина, который может быть связан просто с еще одним остатком цистеина дисульфидным мостиком [71].

1.4.

2.2. Методы анализа оц-антитрипсина ai-AT фокусирования можно определить с а помощью также изоэлектрического показать, есть (полуколичественно, антитрипсиновая недостаточность или нет) [72]. Также, полуколичественно, концентрацию можно определить с помощью гель-электрофореза [73]. Иммуноферментный метод анализа aj-антитрипсина В качестве антитела можно используют антисыворотку козла или кролика, специфичную именно к ai-AT. Для калибровки используют фирменные растворы a r A T известной конце

Альфа-2-макроглобулин (а 2

М) - белок плазмы крови массой 725 кДа, обладает четвертичной структурой [77]. а 2 М известен, как универсальный ингибитор протеиназ, защищающий от избыточной протеолитической активности. Поддерживает протеолитическую активность крови на должном уровне. Ингибирует трипсин, химотрипсин, плазмин, тромбин и каликреин. Участвует в регуляции активности гормонов, факторов роста и цитокинов [78]. Концентрация в плазме крови здорового человека составляет в среднем 2мг

Плазминоген - минорный белок сыворотки крови, состоящий из 791 аминокислотного остатка. Синтезируется клетками печени. Разные модификации плазминогена могут иметь массу от 80 до 92 кДа [83]. Под действием различных активаторов в плазминогене разрывается связь между аргинином-560 и валином-561 и плазминоген превращается в плазмин белок массой 65 кДа [84]. Плазмин обладает протеолитическои активностью (как сериновая протеаза) и способен расщеплять сгустки фибрина. Таким образом, плазмин способ

2.1. Предпосылки для разработки нового способа получения изотопомеров Возможность введения в карбоксильные группы аминокислот изотопа 1 О 1 О О путем обмена с водой Нг О в кислой среде была продемонстрирована ранее в работе [34]. Тем же способом изотопная метка О может быть введена в карбоксильные группы пептидов и белков. Однако в этом случае во избежание побочных реакций обмен должен быть остановлен на уровне, достаточном для использования меченого вещества в качестве внутреннего стандарт

Образец белка или пептида растворяли в воде Н 2 0 и добавляли известное количество трифторуксусной кислоты (ТФУ, TFA). Обмен проходил при нагревании. Использование в качестве кислого агента в реакции обмена именно ТФУ обусловлено следующими ее свойствами: он является достаточно сильной кислотой (рКц

0.3), она доступна в безводном виде и обладает высокой летучестью, что позволяет быстро остановить реакцию высушиванием пробы в вакууме. Первичные структуры пептидов и белков, в которые ввод

Для получения практически всех нужных стандартов для пептидов нами использовалась концентрация ТФУ

8.2% (

0.74

М) и Т=50°С, время для разных образцов выбирали экспериментально по результатам масс- спектрометрического анализа. В связи с тем, что в этих условиях хотя и сохранялись пептидные связи, но можно ожидать частичное дезамидирование, в работе проведена оценка скоростей этого процесса на примере дезамидирования дансильного производного глутамина (DanGln), а также фенил

Для определения концентрации аналит (биопробу) смешивают с его изотопомером (стандартом). Возникает вопрос, при каком их соотношении целесообразно проводить определение концентрации аналита. Для этого провели специальный эксперимент. Эксперимент. Готовили смеси аналита (Анг II) и его изотопомера, где содержание аналита составляет от 0 до 100% с шагом в 10%. По 3-4 смеси с каждым соотношением. После чего регистрировали масс-спектры смеси и выбирали фрагмент, соответствующий ангиотензину П. Рез

1. Разработан новый метод получения изотопомеров, имеющий следующие преимущества:

а) метод получения изотопомеров доступен в лабораторных условиях и требует

0.5-4 часа времени. Степень введения метки можно легко контролировать масс-спектрометрическим анализом (отобрать аликвоту из реакционной среды и провести масс-спектрометрический анализ). При необходимости процесс может быть остановлен разбавлением с последующим испарением летучих компонентов;

б) этот метод не требует х

Помимо простых пептидов, изотопная метка может быть успешно введена и в высокомолекулярные соединения, такие как полипептиды и белки.

Введение изотопа 0 в полипептиды и белки, не имеет принципиальных отличий от введения их в пептиды. Однако в связи с высокими значениями молекулярных масс полипептидов и белков и их широким изотопным распределением, вводится дополнительная стадия ферментативного гидролиза (обычно, трипсинолиза). Это обеспечивает достаточное разрешение и точность изме

С применением нового способа получения изотопомеров получен изотопомер альбумина. Изотопомер альбумина смешивали с каждым из образцов сыворотки крови, после чего проводили денатурацию белков - в течение суток выдерживали в 1% ТФУ в условиях получения изотопомеров. В настоящей работе показано, что альбумин в сыворотке крови и чистый 94 альбумин гидролизуются трипсином с разной скоростью. После обработки кислотой, они гидролизуются одинаково. Концентрацию альбумина в полученном стандарте опред

3.1.2. Схема масс-спектрометрического определения концентрации оцантитрипсина и а2-макроглобулина При прямом масс-спектрометрическом анализе пики триптических пептидов минорных белков «закрыты» пиками мажорных белков - альбумина, иммуноглобулина, комплемента СЗ. Концентрацию остальных белков можно определить только после предварительного фракционирования. В данной работе предлагаются подходы по определению концентрации минорных белков сыворотки крови на основе их функциональных свойств -

Для масс-спектрометрического стрептокиназу анализа использовали препараты, содержащие от разных производителей: (Стр-Бел); Стрептокиназа Стрептокиназа "KabiVitrum", "Белмедпрепараты", Беларусь Швеция (Стр-К) и Стрептокиназа "Behring Werke", Германия (Стр-BW). Представлялось целесообразным оценить удельную активность стрептокиназы также с использованием масс-спектрометрии, поскольку, по данным литературы, именно по этому параметру препараты значительно отли

Разработаны и апробированы оригинальные схемы определения концентрации следующих белков сыворотки крови с использованием нового способа получения изотопомеров: 1. альбумина; 2. сц-антитрипсина и а2-макроглобулина; 3. Определения активности стрептокиназы

Заключение В работе представлена методологическая и теоретическая база массспектрометрического определения концентрации различных белков и пептидов, основанная на использовании изотопомеров. Она обеспечивает развитие методов и средств