Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Электрохимические биосенсоры для анализа эстераз в смеси : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.15, 03.00.23

Год: 2008

Номер работы: 52006

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

3. Стабилизация тирозиназных и холиноксидазных электродов, изготовленных по методу послойного нанесения полиэлектролитов

3.1.

Стабилизация тирозиназного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов

3.1.

Стабилизация холиноксидазного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов

3.1.2. Оптимизация условий одновременного электрохимического определения фенола и холина

3.1.

2.1. Оптимизация рабочего потенциала холиноксидазного ; 6 электрода

3.1.

2.2. Влияние холиновьгх и фениловых эфиров на электрохимическое определение фенола и холина

3.1.3. Определение холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродного электрохимического биосенсо

Взаимодействие тирозиназы и холиноксидазы с полиэлектролитами нелинейной архитектуры в водных растворах

3.2.

1.2. Влияние полимерных звезд на активности тирозиназы и холиноксидазы в водных растворах

3.2.

1.3. ИК-спектры комплексов тирозиназы и холиноксидазы с полимерными звездами

3.2.

Электроды, полученные на основе комплексов ферментов с полимерными звездами

3.2.

1.5. Электроды различных конструкций на основе холиноксидазы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры

3.2.

1.6. Электроды различных конструкций на основе тирозиназы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры

3.2.2. Создание алкогольоксидазного биосенсора по методу послойного нанесения полиэлектролитов

3.2.

2.1. Включение алкогольоксидазы в состав наноструктурированных пле

Одновременное определение активности эстераз крови позволяет осуществлять биомониторинг жизненно важных метаболических процессов. Так, знание активностей эстераз крови позволяет оценивать степень воздействия фосфорорганических соединений на организм человека, а осуществлять быструю диагностику над отставленной использованием нейротоксичности, также осуществлять контроль антихолинэстеразных препаратов при лечении болезни Альцгеймера. Поэтому одной из важных задач медико-экологического монитор

Ацетилхолинэстераза (АХЭ, ЕС

3.1.

1.7) обнаружена в эритроцитах, плазме, фибриллярных нервах, а также в ряде других тканей, таких как симпатические и парасимпатические ганглии, парасимпатические окончания органов, моторные окончания двигательных нейронов, потовые железы, эмбриональные ткани. Активность АХЭ в крови человека составляет в среднем 4-5 Е/мл, при этом 92% активности фермента сосредоточено в эритроцитах и 8% - в плазме. За единицу активности холинэстераз принимают количе

Бутирилхолинэстераза (БХЭ, ЕС

3.1.

1.8), также называемая сывороточной холинэстеразой или псевдохолинэстеразой, находится в центральной и периферической 17 нервной системе и других тканях. Наибольшее количество БХЭ сосредоточено в печени и в плазме крови. Средняя активность БХЭ в крови человека составляет 2-7 Е/мл.

а) Строение БХЭ БХЭ представляет собой белковый молекулярный комплекс, состоящий из нескольких субъединиц, молекулярная масса которого колеблется от 345 до 370 к

1.3. Карбокснлэстераза Карбоксилэстеразы (КЭ, ЕС

3.1.

1.1.) млекопитающих представляют собой 20 большую группу ферментов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме и цитозоле клеток многих тканей [37, 38]. Максимальная карбоксилэстеразная активность была найдена в микросомах печени. Достаточно высокая активность характерна для плазмы. Также КЭ содержатся в тонком и толстом кишечнике, желудке, мозге, моноцитах и макрофагах. КЭ плазмы синтезируются в печени и секретируются в к

В данном разделе рассмотрены описанные в литерагуре методы определения эстераз крови, а также проанализированы существующие подходы к их анализу в смеси.

1.1.

2.1. Методы определения эстераз В настоящее время существует несколько подходов к определению активности эстераз. В основе этих методов лежит измерение скорости ферментативного гидролиза субстратов под действием определяемых ферментов. Наиболее распространенными методами регистрации аналитического сигнала, образующегося в результате ферментативной реакции, являются: спектрофотометрия, флуориметрия, радиометрия, потенциометрия и амперометрия.

а) Определение активности холинэстераз Наибол

2.2. Методы определения эстераз в смеси Существует два подхода к дискриминационному анализу эстеразной смеси (здесь и далее под «дискриминационным анализом» подразумевается анализ, позволяющий вычленять вклады каждого компонента в смеси). Первый подход предполагает использование специфических ингибиторов эстераз и измерение остаточной эстеразной активности. Второй подход основан на различной субстратной специфичности эстераз. Определяя коэффициенты чувствительности эстераз к различным субстра

Бурное развитие геномики и протеомики, многочисленные исследования в области создания лекарственных препаратов и многие другие биотехнологические исследования послужили мощным импульсом для разработки новых методов, позволяющих быстро и надежно производить скрининг и селекцию ферментов, их субстратов и ингибиторов. Разработанные в последнее время методы иммобилизации белков на твердых поверхностях с субмикронным и микронным пространственным разрешением позволяют говорить о возможности создани

Одним из наиболее успешных подходов к созданию поверхностей с заранее заданными свойствами является метод послойного нанесения полиэлектролитов (ПНП) (layer-by-layer technology, LBL technology) — метод электростатической самоорганизации полиэлектролитов, представленный в 1994 году Ю.М. Львовым и Г. Дехером [65]. Технология основана на последовательной адсорбции положительно и отрицательно заряженных возможности полиэлектролитов и предоставляет конструирования» практически неограниченные для «

Методика последовательной адсорбции полиэлектролитов на твердую поверхность заключается в следующем: на первой стадии производят зарядку стеклянной, кварцевой или кремниевой подложки окислением или используют свежесколотую слюду или графит, несущие отрицательный заряд. Предположим, что поверхность заряжена отрицательно. Далее подложку помещают в водный раствор, содержащий заряженный поликатион. Полиэлектролит адсорбируется на подложке и удерживается на ней вследствие электростатического взаим

Холиноксидаза, общие сведения Холиноксидаза (Е.С.

1.1.

3.17) - флавин-зависимый фермент, катализирующий четырехэлектронное окисление холина до бетаина (Км= 1,2

мМ) и бетаинового альдегида (Км = 8,7

мМ) в качестве промежуточного продукта (Рис. 1-12) [83]. Холиноксидаза из Arthrobacter globiformis впервые была описана Ikuta и др. в 1977 году [84]. Для данного фермента известна как мономерная форма [83, 84], так и димер [85]. Молекулярная масса фермента составляет 71000-8

Тирозиназа, общие сведения Тирозиназа или полифенолоксидаза (ЕС

1.14.

18.1) - медьсодержащий фермент с двумя активными центрами на молекулу, каждый из которых включает два атома меди, расположенных на расстоянии 3 А друг относительно друга [90, 91]. Тирозиназа катализирует две различные реакции: о-гидроксилирование монофенолов (гидроксилазная активность) и окисление о-дифенолов до о-хинонов (оксидазная активность) [92, 93]. Молекулярная масса фермента составляет 116000-128000 г/мо

Принцип работы тирозиназного и холиноксидазного биосенсоров, ранее созданных в нашей лаборатории по методу ПНП [7, 98, 99], представлен на рис. 1-13 и рис. 1-14 соответственно. Аналитический сигнал в случае тирозиназного биосенсора формируется за счет электровосстановления о-хинона до пирокатехина при потенциале -150 мВ, в случае холиноксидазного биосенсора - за счет электроокисления Mn(II/III) до Mn(IV) при потенциале +480 мВ относительно Ag/AgCl стандартного электрода. В качестве подложки в

Общие сведения Полимеры это особый класс химических соединений, состоящих из макромолекул. Макромолекула представляет собой совокупность атомов или атомных групп, разных или одинаковых по химической природе, соединенных ковалентными связями в длинную, гибкую, цепную конструкцию. Полимеры построены из повторяющихся моиомерных остатков. Если мономерные остатки одинаковы по химической природе, то такие полимеры носят название гомополимеры. Полимерные соединения, цепи которых содержат несколько р

ПЭНА ведут себя несколько отлично от линейных аналогов. Отличие в строении макромолекул затрагивает целый ряд свойств полимеров: реологических, кислотноосновных и т.д. Именно эти особенности в настоящее время вызывают интерес у исследователей в связи с тем, что совсем недавно стало возможным получать ПЭНА с узким молекулярно-массовым распределением, т.е. макромолекулы определенной структуры с известным и одинаковым количеством лучей и их степенью полимеризации.

Полимерная звезда представляет собой макромолекулу, состоящую из остова и лучей, отходящих от него (рис. 1-21). Основным отличием полимерных звезд от полимерных щеток является то, что размер остова мал по сравнению с длиной лучей. Остов полимерной звезды Луч полимерной звезды со степенью полимеризации п Рис. 1-21. Структура полимерной звезды на примере: остов - глюкоза, лучи — полиакриловая кислота. В литературе представлены три принципиальных метода получения полимерных звезд. Эти подход

ATRP-полимеризация является одним из видов псевдоживой полимеризации, а именно, полимеризацией с переносом атома. При псевдоживой радикальной полимеризации растущие цепи большую часть времени находятся в неактивном состоянии и значительно меньший отрезок времени в активном. Это происходит благодаря обратимым актам ингибирования. Впервые псевдоживую радикальную полимеризацию реализовали в начале 1980-х годов при помощи специальных веществ, называемых «инифертерами». Это название является соста

Описанным выше способом были получены полимерные звезды с узким молекулярно-массовьш распределением, определенным количеством полимерных лучей определенной степени полимеризации в 2005 году в лаборатории Акселя Мюллера (Университет Байройт, Германия). Рассмотрим кратко синтез полианионной звезды [8]. В качестве остова были взяты углеводы с различным количеством гидроксильных групп, а именно, для получения 5лучевой звезды - а-,0-Глюкоза, 8-лучевой - сахароза, 21-лучевой - р-циклодекстрин. Пер

В литературе представлено несколько попыток синтеза поликатионной звезды. В более ранних работах для этих целей проводили полимеризацию винилпиридина [114]. Также существуют примеры синтеза поликатионных звезд с гетерополимерными лучами [108], состоящими из коротких последовательностей полистирола и длинных поли-2винилпиридина. Вышеперечисленные методы синтеза относятся ко второму способу получения полимерных звезд, а именно, когда предварительно синтезируют лучи и уже после формируют остов м

Моделирование поведения полиэлектролитов заряженных полимеров в растворе позволяет в растворах представить представляет в настоящее время широкий теоретический и практический интерес. Понимание поведения конформацию полиэлектролитов, их заряд и другие характеристики. Большинство работ посвящено линейным полимерам и полиэлектролитам [116, 117]. Несмотря на то, что проблемы моделирования таких объектов до конца не решены, моделирование более сложных, регулярно разветвленных полиэлектролитов при

На сегодняшний день в литературе не описаны биосенсоры на основе алкогольоксидазы, изготовленные по методу ПНП. В данном разделе рассмотрены структурные особенности и свойства алкогольоксидазы, а также методы создания биосенсоров на ее основе. Особенное внимание уделено различным типам существующих электрохимических сенсоров на этиловый спирт, их достоинствам и недостаткам, а также аналитическим характеристикам, к которым следует стремиться при создании амперометрического алкогольоксидазного

Важным источником ферментов являются различные виды дрожжей, плесневых грибов и бактерий. Среди них особое место занимают метилотрофные дрожжи, которые благодаря наличию сильного промотора алкогольоксидазного гена (pAOXl), стали выгодным организмом-хозяином для экспрессии промышленно важных белков и ферментов. Метилотрофные дрожжи — это эукариотические организмы, которые способны*, усваивать метиловый спирт как единый источник углерода и энергии. Большинство этих организмов принадлежат к рода

Алкогольоксидаза — ключевой фермент метилотрофного обмена метилотрофных дрожжей. Этот фермент является флавопротеином, который содержит 67 флавинадениндинуклеотид (FAD) как простетическую группу, связанную с апоферментом нековалентными связями. Активный белок является октамером (рис. 1-35), который состоит из восьми идентичных FAD-содержащих субъединиц с общей молекулярной массой 600 кДа. а) б) Рис. 1-35. Изображение

а) биологической молекулы алкоголъоксидазы и

б) несимметричн

Алкогольоксидазу выделяют в высокоочищенном состоянии из нескольких видов метилотрофных дрожжей. Как обычно, процедура очистки фермента включает несколько стадий: механическое разрушение клетки, фракционное осаждение сульфатом аммония, ионообменная хроматография на анионитах и гель-фильтрация на сефадексах. Искомая активность очищенного фермента изменяется в широких пределах - от 5 до 50 мкмоль/(мин-мг) в зависимости от вида дролокей и схемы очистки. В окисленном состоянии флавопротеин имеет

Количественное определение спирта с высокой чувствительностью и селективностью очень важно для клинических и судебных целей, а также для сельскохозяйственных и экологических нужд, в биохимических исследованиях, в пищевой промышленности для контроля процесса брожения и качества продуктов. При изготовлении биосенсоров для определения спиртов наиболее часто обратимо окисляет простые алифатические и используются алкогольоксидаза и КАБ+-зависимая алкогольдегидрогеназа. Алкогольдегидрогеназа арома

Анализ этанола при использовании амперометрических сенсоров проводится либо по количеству потребляемого молекулярного кислорода, либо по количеству образующегося в ходе каталитической реакции пероксида водорода. При этом катодный ток восстановления молекулярного кислорода протекает при потенциале -600 мВ, а анодный ток окисления пероксида - при потенциале +600 мВ относительно электрода сравнения (Ag/AgCl).

а) амперометрическае сенсоры на основе алкогольоксидазы, детектирующие потребляе