Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Инженерия коферментной специфичности формиатдегидрогеназ из метилотрофных бактерий и растений : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.15

Год: 2008

Номер работы: 51995

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

2. Повышение эффективности экспрессии тройных мутантов NADP*-зависимых ферментов РзеФДГ 83 69 74 активности 69 полученных мутантов 51 53 55 55 56 56 59 60 60 60 61 61 62 63 64 64 65 65 65 66 66 67 69 4

3. Повышение химической и температурной стабильности зависимых РзеФДГ

4.1.

3.1. Объединение мутаций, расширяюпщх рН-оптим5ш, с мутациями, повьппающими температурную и химическую стабильность

4.1.

Введение замены Glul70Asp в NADP^-зависимый мутант РзеФДГ SM(8)SM9-20 88 85 NADP*85

4.2. ПОЛУЧЕНИЕ NADP^-ЗАВИСИМЫХ ФОРМ РАСТИТЕЛЬНЫХ ФДГ 91

4. Изменение коферментной специфичности ФДГ из G. max и А. thaliana 5. ВЫВОДЫ 6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95 100 101 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ФДГ РзеФДГ - формиатдегидрогеназа - формиатдегидрогеназа из Pseudomonas sp. 101 СЬоФДГ - формиатдегидрогеназа из Candida boidinii 8сеФДГ - формиатдегидрогеназа из Saccharomyces cerevisiae АгаФДГ - формиатдегидрогеназа из резуховидки TeumArabidopsis thaliana 8оуФДГ - формиатдегидрогеназа из сои Glycine max NAD* NADH NADP* NADPH ADP АТР dNTP MDR PDB SDR АДГ АлДГ ГАФД

Коферментная специфичность КАВ(Р)(Н)-зависимых ферментов

2.1.1. Структура и роль NAD* и NADP* N A D * и NADP* - важнейшие коферменты, играющие огромную роль во всех живых клетках. Молекула N A D * представляет собой дднуклеотид, состоящий из остатков азотистых оснований - аденина и никотинамида, соединенных пирофосфатной группой через остатки рибозы (рис.

2.1). NADP* отличается от N A D * всего лишь тем, что 2'-гидроксильная группа рибозы аденозина в молекуле NADP* заменена остатком фосфорной кислоты. NH, о" НО 'О N о I I -Р-0—: N .0.

Строение КАВ* и NADP* Однако в живых клетках эти соединения вьшолняют принципиально различные функции. Если NADP* используется организмами в основном в восстановительных реакциях анаболизма, то NAD*, напротив, участвует преимущественно в окислительных процессах катаболизма [1, 2]. Это позволяет клетке осуществлять раздельную регуляцию процессов получения N A D H , необходимого для синтеза АТР, и синтеза различных соединений с участием N A D P H . Осуществление такого разделения возможно в

В качестве используют меры специфичности (k^JKu)^^^ дегидрогеназ (kcJKuf^^*. к NAD* обьршо отношение к Эта величина в англоязычной литературе назьшается «coenzyme preference)) (специфичность к коферменту). При получении мутантов с измененной коферментной специфичностью возникает вопрос выбора количественной характеристики этого изменения. Рассмотрим различные типы выражений величины коферментной специфичности мутантного фермента. 1. Отношение (kcJKu)^^^ к (kcatfK.uf^^^ для одного и

2.1.

3.1. Строение коферментсвязывающих доменов дегидрогеназ В-специфичные дегидрогеназы 2-гидроксикислот обьршо состоят из 2, 4, 6 или 12 плотно упакованных субъединиц. Каждая субъединица состоит из двух доменов коферментсвязьшающего и каталитического, причем коферментсвязьшаюш;ие домены имеют схожую трехмерную структуру, несмотря на значительное различие первичных последовательностей. Наибольшее структурное сходство обнаруживается среди коферментсвязьшающих доменов В-специфичных дегидроген

Разнообразие мотивов укладки по Россману [12]. Кружками обозначены а-спирали, треугольниками - Р-тяжи Таблица

2.2 Структурная классификация белков с укладкой по Россману в соответствии с данными SCOP Название семейства Число видов доменов 28 53 18 10 2 Примечания ADH-подобные, С-концевой домен Тирозин-зависимые оксидоредуктазы (SDR) GPDH-подобные, N концевой домен NAD^-домен формиатглицератдегидрогеназ Сирогем-синтетазаподобные, N-концевой домен LDH-подобные, N-концевой домен 6-PGDH-пo

3.3. Другие особенности связывания кофермента Важную роль во взаимодействии кофермент-фермент играет диполь аспирали. Дипольный момент а-спирали это результирующая индивидуальных дипольных моментов пептидных остатков спирали. Его можно смоделировать, поместив половину положительного заряда около Кконца цепи и половину отрицательного - около С-конца [25] Пирофосфатная группа кофермента находится у М-конца спирали а В и взаимодействует с диполем этой так назьшаемой динуклеотид-связьшающей спи

В 1980 г. Бранден [27] описал, каким образом укладка NAD*- связьшающих доменов образует сайт связывания. Эта работа послужила основой для последующих более детальных исследований сайта связьшания NAD(P)* и влияния на специфичность отдельных остатков сайта. В 1985 и 1986 гг. вьппли работы Виренги и Хода [26]. Исследователи рассмотрели 6 белков (АДГ, ДЦГ, ГАФДГ, /7-гидроксибензоатгидроксилаза, ГТР и ДГФР) и суммировали результаты предьщущих исследований [28]. Бьшо показано, что адениновая част

2.2. Изменение коферментной специфичности Задачу изменения коферментной специфичности необходимо решать в рамках экспериментов по исследованию структуры и свойств центра связьшания коферментов. Изменение коферментной специфичности помогает понять, каким образом происходит столь избирательное распознавание кофермента белком, какие остатки отвечают за связывание NAD(P)(H) и какие взаимодействия происходят в центре связьшания. Практический интерес к изменению специфичности NAD(P)*- зависимых

2.2.1. Изменение специфичности от NADP* к NAD*

Укладка глутатионредуктазы Е.соИ относится к категории РАВ/КА1)(Р)*-связьшающих доменов. Эталонным мотивом для таких доменов является параллельный ß-лист из 5 тяжей, с одной сторотт от которого уложены а-спирали, а с другой - антипараллельный ß-лист из 3 тяжей. Эксперименты Скруттона, проведенные с глутатионредуктазой, были первыми по изменению коферментной специфичности КА1)(Р)*-зависимых дегидрогеназ [24]. Хотя изменение специфичности в направлении от N A D P * к NAD* представляет более с

1.2. Альдегиддегидрогеназа (АлДГ) Это один из ферментов, входящих в состав бактериальной люциферазы. Его укладка относится к типу АлДГ-подобных укладок. Такая укладка состоит из двух похожих доменов. В основе каждого из них - Р-лист из пяти тяжей, окруженный с обеих сторон а-спиралями. АлДГ из бактерий Vibrio harveyi в терминах отношения величин ксаЛ^и использует NADP* в 37 раз более эффективно, чем NAD* (табл.

2.4). Такая эффективность достигается за счет очень хорошего значения Км (

1.3. Алкогольдегидрогеназа из Ranaperezi Укладка относится к типу С-концевых россмановских доменов GroESподобных белков. Собственно GroES белки (белки теплового шока) представляют собой полностью р-белки, но могут содержать С-концевой домен с другими типами укладки. Фермент принадлежит к семейству среднецепочечных дегидрогеназ (MDR, medimn chain dehydrogenases). Эта алкогольдегидрогеназа из желудочных тканей лягушки - единственная АДГ из позвоночных со специфичностью к N A D P * . Стру

Работы [59, 60] посвящены изменению коферментной специфичности ксилозоредуктазы. Со структурной точки зрения фермент относится к семейству альдо-кеторедуктаз, его укладка представляет собой бочонок из 8 параллельных Р-тяжей и 8 а-спиралей. Сайт связьшания N A D P * расположен в большом глубоком эллипсоидном кармане на С-конце Р-листа, кофермент связьшается в вытянутой конформации. Этот фермент обладает дуальной специфичностью - его сродство к N A D P * всего в 34 раза вьппе, чем к N A D * .

2.2.2. Изменение специфичности от КАВ* к NADP*

В экспериментах Боканегры [65] впервые удалось получить остатков, высокоэффективный КАОР*-зависимый фермент путем замен участвующих в разнородных взаимодействиях в активном центре КАО*зависимого фермента. Специфичность дигидролипоамиддегидрогеназы Е.соИ изменили почти полностью - если фермент дикого типа был абсолютно специфичен к КАО*, то мутант оказался в 2500 раз более специфичен к МАВР*. При этом активность мутанта с КАВР* в 1,25 раза превосходила активность фермента дикого типа с КАВ

1.1). Как и в случае глутатионредутктазы, укладка этого фермента относится к семейству РАВ/ЫАВ(Р)*-связьшающих доменов. В экспериментах [65] ряд остатков в конце второго Р-тяжа заменили на остатки, несущие частичный положительный заряд, чтобы благоприятное электростатическое окружение для 2'-фосфатной создать группы МАВР*. Кроме того, остаток глутаминовой кислоты О1и203 бьш заменен на остаток валина. В МАВ*-зависимом ферменте карбоксильная группа глутамина образует водородную связь с

специфичность Еще одцн пример удачного изменения коферментной специфичности эксперименты по полз^ению МАВР*-зависимой изопропилмалат- дегидрогеназы [70]. Укладка этого фермента относится к типу изоцитрат- изопропилмалатдегидрогеназоподобных. Для них характерна трехслойная а^а структура. Р-лист смешанный, состоит из 10 тяжей, тяжи с 5 по 9 антипараллельны остальным. Первые эксперименты по изменению коферментной специфичности 3изопропилмалатдегидрогеназы (ИП]У1ДГ) от КАВ* к КАВР* бьши провед

2.3. Фосфитдегидрогеназа из Pseudomonas stützen для Данный фермент содержит мотив GxxGxGxxG, характерный некоторых дегидрогеназ D-гидроксикислот, и остаток глутаминовой кислоты в положении +18 к этой последовательности [86]. Поскольку на данный момент не существует экспериментальной трехмерной структуры этого фермента, авторы воспользовались рентгеновской структурой гомологичного фермента - D-лактатдегидрогеназы (ЛДГ). NAD^-связьшающие домены этих ферментов относятся к семейству формиат-гл

2.4. Ксилитолдегидрогеназа из Pichia stipitis Укладка этого фермента относится к семейству С-концевых алкогольдегидрогеназоподобных доменов, как и алкогольдегидрогеназа из Rana perezi (см. разд.

2.2.

1.3), и, таким образом, является классической укладкой по Россману. Полного изменения специфичности данного фермента удалось добиться после введения нескольких замен [89]. На основании выравнивания аминокислотной последовательности ксилитолдегидрогеназы с гомологичным NADP^-зависим

2.3. Коферментная специфичность формиатдегидрогеназы

Формиатдегидрогеназа фермент, катализирующий окисление формиат-иона до углекислого газа с сопряженным восстановлением КАВ* до КАВН. Как уже говорилось, термин «формиатдегидрогеназа» объединяет несколько групп ферментов, отличающихся субъединичным составом и наличием в молекуле фермента ионов металлов или простетических групп. Отдельную группу представляют собой NAD*-зaвиcимыe формиатдегидрогеназы, которые состоят из двух идентичных субъединиц и не имеют в активном центре ни ионов металлов,

Наиболее изучены формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp.lOl [98] и дрожжей Candida boidinii [99-101]. Для ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.lOl определены с высоким разрешением структуры апофермента, тройного комплекса с N A D * и азидом (PDB-коды 2NAC и 2NAD*, соответственно) [ 102, 103 ], а также структуры некоторых мутантов. Все ФДГ можно разделить на две большие группы по степени сходства первичной последовательности и структуры (рис.

2.8). К одной группе относят ФДГ из дрожже

Растительные ФДГ были обнаружены одновременно с дрожжевыми и бактериальными ферментами егце в конце 40-х - начале 50-х годов прошлого столетия [118], однако по сравнению с последними практически не охарактеризованы. В растениях формиатдегидрогеназа локализована в митохондриях, но не в цитоплазме [119, 120]. Она является белком стресса [121-123]. В стрессовых условиях содержание ФДГ резко возрастает и достигает 9% от общего количества митохондриальных белков [ 120 ]. ]У1алая 52 исследованност

В экспериментах по генной инженерии использовали только реактивы марки «Molecular Biology Grade»: акриламид, М,М-метиленбисакриламид, ЭДТА и мочевина («Bio-Rad», США); трис-(гидроксиметил)-аминометан («Merck», Германия); борная кислота («Sigma», США); ТЕМЕД и персульфат аммония («1BI», США); амберлит («Serva», Германия). Эндонуклеазы рестррпшии EcoRI (20 ед/мкл), SacII (10 ед/мкл), Ndel (10 ед/мкл), Xhol (10 ед/мкл). Sali (10 ед/мкл), BseXSI (10 ед/мкл), Х т а Ш (10 ед/мкл) были фирмы «New

Направленный мутагенез осуществляли с помощью цепной реакции (ПЦР) (рис.

3.1) [130]. полимеразной

Введение каждой мутации проводили в два этапа. На первом этапе проводили две ПЦР. В первой реакции использовали прямой праймер на 3'-конец амплифицируемого участка и обратный праймер с мутацией. Во второй реакции участвовал обратный праймер на 5'-конец и прямой мутагенезный праймер. Продукты каждой реакции очищали от праймеров и затем проводили с ними третью объединяющую ПЦР. В реак

Для очистки полученных ПЦР-продуктов от белков к 20 мкл реакционной смеси добавляли 1 мкл 0,2 М раствора ЭДТА (рН 7,8) и равный объем фенол-хлороформа (1:1), насьпценного ТЕ-буфером. Смесь тщательно перемешивали и центрифугировали на микроцентрифуге Eppendorf 5415С (Германия) при 14 ООО об/мин в течение 5 мин. Верхнюю фракцию отбирали, переносили в чистую пробирку и к ней добавляли равный объем хлороформа для удаления остатков фенола. После повторного центрифугирования при тех же условиях сн

3.2.3. Рестрикция Д Н К Рестрикцию рекомендованном ДНК проводили в течение 1-2 ч в буфере, производителем рестриктазы, при 37°С в суммарном объеме 20 мкл. Для гидролиза фрагментов ДНК (200 нг/мкл) брали 2-4 ед. рестриктазы. В случае, если рестрикцию необходимо было провести по двум сайтам рестрикции, использовали две рестриктазы. Если обеим рестриктазам требуется буферный раствор с одинаковой ионной силой (например, ХЬо! и ЕсоК1), их добавляли в одну пробирку и проводили рестрикцию как обь

Электрофорез проводили в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ (40 мМ трис, 20 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА, рН 8,5) при напряженности электрического поля 2-3 В/см. В агарозный гель добавляли раствор бромистого этидия до конечной концентрации 1,6 мкг/мл и визуализировали на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 260 нм.

В пробирку объемом 500 мкл добавляли вектор и вставку в молярном соотношении один к двум, 2,5 мкл 10-кратного лигазного буфера, поставляемого вместе с лигазой, и воду до общего объема 24 мкл. Реакционную смесь инкубировали 5 мин при 37°С, 5 мин при 0°С, добавляли 1 МБШ ДНК-лигазы бактериофага Т4 («Сибэнзим», Россия) и инкубировали II­ IS ч при 14°С.

3.2.6. Трансформация клеток Е.соИ Трансформацию клеток Е.соИ штаммов TG1 или BL21 (pLysS) проводили согласно методике, описанной Манниатисом и соавторами [ 131]. 40 мкл ночной культуры клеток Е.соИ разбавляли в 100 раз в среде 2YT и вьфащивали при аэрировании в течение 2-3 ч при 37°С до величины Абоо ^ 0,07. Далее культуральную жидкость центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин в центрифуге «Eppendorf 5403» при 4°С. Осадок клеток охлаждали до 0°С, ресуспендировали в 1 мл охлажденного до 0°С 50

3.2.7. Выделение плазмидной ДНК Вьщеление плазмидной ДНК проводили с помощью набора реагентов фирмы «QIAGEN». 4 мл ночной культуры клеток Е.соИ TG1, содержащих плазмиду, центрифугировали на центрифуге «Eppendorf 5415» в течение 5 мин при 6000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 300 мкл буфера PI (100 мкг/мл рибонуклеазы А, 50 мМ трис-НС1, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0). К смеси добавляли 300 мкл лизисного буфера Р2 (200 мМ NaOH, 1% SDS), осторожно перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температу

Ночную культуру клеток Е.соИ BL21 (pLysS), трансформированных плазмидой с геном ФДГ, которую требовалось культивировать, разбавляли в 1000 раз для полз^ения посевного материала, вносили в среду ампшщллин (200 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл). Когда оптическая плотность клеток при 600 им достигала величины 0,8, посевной материал переносили в колбу для культивирования в количестве 10% от общего объема среды. Препаративную наработку биомассы клеток с требуемыми мутантами проводили в качалочны

ФДГ дикого типа и мутантные формы ФДГ, экспрессированные в клетках E.coli BL-21 (pLysS), вьщеляли и очищали по стандартной методике, разработанной для ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.lOl [132]. Клетки ресуспендировали в 10 мл 0,1 1VI калий-фосфатного буфера, 0,02 1VI ЭДТА, рН 8,0. Буфер добавляли из расчета 10 мл на 1 г сырой биомассы. Клеточные стенки разрушали при 0°С на ультразвуковом дезинтеграторе «BramiSonic» (Германия), клеточный дебрис удаляли на центрифуге «Beckman J-21

3.2.10. Измерение активности нативной и мутантной ФДГ Активности нативной и мутантных форм ФДГ определяли в 0,1 М калий-фосфатном буфере при рН 7,0 на спектрофотометре «Shimadzu U V 1601 PC» (Германия) при 30°С по накоплению NAD(P)H на длине волны 340 нм (ез40^^"= 6220 сы \ £340^™= 6200 М'^ см'^). Концентрации N A D * и формиата натрия в кювете составляли 1,5 и 300 мМ, соответственно. Концентрация NADP* в кювете была 3 мМ. Измерение точной концентрации исходных растворов NAD(P)* прово

Константу Михаэлиса определяли из зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации одного из субстратов в условиях насьпцения по второму субстрату. Реакцию инициировали добавлением раствора фермента (0,01-0,02 мг/мл). Полученные результаты обсчитьшали методом нелинейной регрессии с помощью программы «Origin

7.0».

рН всех растворов измеряли при 30°С на рН-метре фирмы «Phannacia» (Швещм), откалиброванном по 3 стандартным буферам в диапазоне рН от 4 до 10. Ошибка определения составляла 0,05 единицы рН.

Измерения кинетических параметров проводили, как бьшо описано вьппе, в диапазоне рН от 6 до 10. При этом рН реакционной смеси определяли как до начала реакции, так и после ее окончания, при помощи рН-метра. Ошибка измерения составляла 0,05 единицы рН.

полученных мутантов Термостабильность мутантных форм ФДГ измеряли в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, при температуре 62°С. Для каждого мутанта и нативной ФДГ готовили серию из 8 пластиковых пробирок на 1,5 мл по 60 мкл фермента (0,2 мг/мл) в каждой пробирке. Пенопластовый плотик с пробирками помещали в предварительно прогретый до нужной температуры водный термостат. В определенные моменты времени (см. ниже) пробирки с ферментами переносили из водяного термостата в лед на время более 30 М1ш, п

Компьютерное моделирование планируемых мутантов проводили на основе имеющихся рентгенострз^турных 2NAC данных для ФДГ из Pseudomonas ЛОХ (PDB-код для холофермента и 2NAD для апофермента) на станции молекулярного моделирования SGI Indy (Silicon Graphics, США) с использованием пакета программ hisight II (Accehys Software, США). Выбирали область радиусом 8 А от места мутагенеза, в которой требовалось промоделировать конформации остатков, и с помощью программы «Amber 5» проводили оптимизацию

4.1.1. Расширение рН-оптимума активности NADP^-зависимых РвеФДГ

4.1.

1.1. РасширениерН-оптимума активности NADP^-зависимых мутантов Р8еФДГ на основе мутаци М8 Известно, что в случае формиатдегидрогеназы максимальная скорость реакции Vr^ix постоянна в диапазоне значений рН 6,0-11,0, поэтому уменьшение эффективности катализа при высоких значениях рН связано только с падением сродства фермента к коферменту [ 134]. Ранее бьшо показано, что у NADP^-зависимого мутанта РзеФДГ М8 Км по формиату ниже, чем у мутантов М9 или 1VI10 [ 135]. Поэтому мы решили провести экс

Как уже отмечалось, ранее в нашей лаборатории бьши получены мутанты NADP^-зависимой рекомбинантной формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp.lOl, содержащие помимо замены М9 замены М9-10, М9-20, М9-30. Во всех трех случаях рН-оптимум связьшания кофермента удалось расширить до рН 9,0, но в случае замены М9-30 полученный мутант имеет меньшее сродство к коферменту (рис.

4.3). При рН вьппе 9,0 сродство всех мутантов к коферменту ухудшается. 2 1 I I 9,5 „ 1 0 рН Рис.

4.3. Завис