Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10

Год: 2004

Номер работы: 343902

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

5.9. Спектроскопия ЯМР ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЕ УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ 4eLeg 8eLeg Ac aKdo Ala Am Ara bv., bvs. ЗНОВи Cm COSY Fo Fru Fuc FucN FucN4N Gal GalN GalNA GalNAN Glc GlcN GlcN3NA Gro Hep Hep* Hex 6dHex 6dHexN HexN HexNA HexN3NA HMQC Kdo Kdo8N Ко 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-о-г/гмг/£'/7о-п-//7а/го-нон-2-улозоновая (4-эпилегионаминовая) кислота 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-ь-глм1/е/?о-о-га//о?с7ио-нон-2улозоновая (8-эпилегионаминовая) кислота ацетил ангидро-форма 3-де

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из внепшей и внутренней мембран, разделенных тонким слоем пептидогликана (рис.

2.1.1.). Пептидогликан представляет собой жесткий каркас, придающий форму и прочность бактериальной клетке. Высокоупорядоченная внепшяя мембрана ограничивает поступление в клетку гидрофобных веществ, таких как литические ферменты и некоторые антибиотики, а также солей двухвалентных катионов и вместе с тем осуществляет пассивную диффузию необходимых соединен

Структурные варианты кора различных бактерий заметно более ограничены по сравнению со структурами О-полисахаридов. В частности, в коре всех бактерий присутствует 3-дезокси-В-л^анно-окт-2-улозоновая кислота (Kdo, рис.

1., А), гликозидная связь которой соединяет кор с липидом А. У большинства бактерий кор содержит несколько остатков Ъ-глицеро-и-манио-гептозы (Hep, рис.

1., С), два из которых образуют олигосахарид Hep"-(al->3)-Hep'-(al-»5)-a-Kdo' с остатком Kdo^ замещенным в положение 4 остатком Kdo" или фосфатной группой. Вместо остатка Kdo (Kdo' у бактерий Acinetobacter [18; 19] или Kdo" у бактерий Burkholderia, Serratia и Yersinia [20-24]) может присутствовать стереохимически сходный моносахарид — Г>-глицеро-Г>-тало-ок1-2-упо2оиоъгя кислота (Ко, рис.

1.,

В) [25]. Кор некоторых бактерий содержит В-глицеро-О-манно-гепгозу (Hep*, рис.

1., D) - биосинтетический предшественник Hep [26]. В ЛПС Klebsiella pneumoniae [27;28] и Helicobacter pylori [29-31] (al->2)- или (а1->3)-связанные остатки Hep* образуют гептагликановые цепи, биологическая роль которых неизвестна. но но но он соон но но но соон в но. он Рис.

1. Строение 3 -дезокси-В-л^а(кно-окт-2улозоновой кислоты (Kdo, А), и-глицеро-Отало-окт-2-улозоновой кислоты (Ко, В), Lглицеро-и-манно-гетозы (Hep,

С) и О-глицеро-Пманно-гетозы (Hep*, D). но. но сн,он но он CHjOH D в корах, содержащих Hep, принято делать подразделение на внутреннюю и внешнюю области: к первой относят участок, построенный из остатков Hep и Kdo, а второй состоит в основном из гексоз и гексозаминов. Это подразделение используется и в тех случаях, когда ко внутреннему к

2.2.1. Семейство Aeromonadaceae

1.1. ¥оц. Aeromonas В период 1981-1984 гг. были установлено три частичные структуры кора вида А. hydrophila: ХемотипП Нер-(1-»6)-| P-Glc-( 1 ->4)-Нер"-( 1 ->2)-Нер' GlcN-(l->7)-Hep-(l->3)-l Хемотип III GIc-(l->6)-| 01с-(1 ->4)-Нер"-(1 -^2)-Нер' QuiSN Ас-(1 ->7)-Gal-( 1 -^3)-1 ,__, ,^., А6 p-Gal-(l->4)-| Нер-(1->6)-| p^, Нер*-( 1 ->6)-Нер*-(1 ->6).p-Glc-( 1 ->4)-Нер"-(1 ->2)-Нер' GlcN-(l->7)-Hep-(l->3)-l Недавние исследова

2.2.2. Семейство Alcaligenaceae

2.1. Род Bordetella Bordetella распространенный [38;39]: pertussis продуцирует ЛПС R-типа. Он содержит Hep и широконесущего фрагмент, построенный из лъух. остатков дифосфоэтаноламин остатка Kdo, с присоединенными к нему остатками Glc, GlcN и GlcA GlcN-(l->7)-| r4-PPEtn 01сА-(1-^2)-Нер"-(1->3)-Нер'-(1->5)-К(1о-(2->липидА GalNA-( 1 ->6)-Glc-(P 1 ->4)-l Xl-(l->4)-l Наиболее полный кор присутствует в ЛПС штамма 1414. В нем остаток p-Glc замещен в положение 4 разветвле

2.2.3. Семейство Alteromonodaceae

Shewanella putrefaciens CN32 продуцирует в R-форме, кор которого представляет собой линейный пентасахарид следующего строения [40]: г2-РРЕ\п г4-Р p-Gal/-(l->3)-P-Gal-(1^4)-p-GIc-(l-^4)-Hep*-(l->5)-Kdo-(2->липидA Кор R-штамма Shewanella oneidentis MR-1 имеет уникальное строение сразу в нескольких аспектах [41]: r4-PPEtn (/5)-GaloNAc-(l->4,6)-Gal-(l-^6)-GaI.(l->3)-Gal-(l-i'-3)-Hep*-(l-^5)-Kdo8N-(2->липидA Прежде всего, вместо остатка Kdo, являющегося связующим звеном между ко

2.2 АЛ. Род Bradyrhizobium Из ЛПС штамма Bradyrhizobium (ранее Rhizobium) japonicum 61А101 с и его мутанта JS314 выделен трисахаридный фрагмент кора Мап-(1—>4)-p-Glc-(l->5)-Kdo, а из штамма JS314 также моно-0-метилированный дисахаридный фрагмент Мап4Ме-(1—>5)Kdo [46]. Фрагмент p-Glc-(l->5)-Kdo присутствует в коре Sinorhizobium meliloti [47], а не содержащий О-метильной группы дисахарид Мап-(1—>5)-Kdo входит в кор Rhizobium [4854], что указывает на родственную связь между этими

У бактерий двух изученных родов семейства Burkholderia обнаружены значительные различия в строении кора. В полном коре В. cepacia GIFU 645 остаток Kdo, связывающий кор с липидом А, замещен в положение 4 дисахаридом построенным из остатков Ко и Ara4N, а внешняя область представлена остатком L-Rha [21;55]: Hep'"-(l->7h г(4<-1)-р-01с L-Rha-(l->2)-Hep"-(l-^3)-Hep^-(l->5)-Kdo^-(2->липидA p-L-Ara4N-(l->8)-Ko-(2->4)-' Замещение остатка Ко остатком P-L-Ara4N нестехиомет

Внутренняя область кора С. jejuni, С. coli и С. lari содержит общий структурный элемент следующего строения: Внешний Kop-(Pl->3)-Hep"-(l->3)-Hep'-(l->5)-Kdo ХЗ-1 Lx2 Остаток Hep' замещен фосфоэтаноламином (XI = PEtn) в положение 7 в коре С. jejuni 0:10 и в положение 6 в коре С. jejuni 0:1, 0:2, 0:4, 0:19 (типовой штамм), 0:23 и 0:36 [61-66], а в коре остальных штаммов остаток Hep' не фосфорилирован. Природа заместителя в положении 4 остатка Kdo остается невыясненной. Кор ЛП

1Л. Род Chlamydia Кор Chlamydia ограничен линейным трисахаридом, построенным из остатков Kdo [71-74]: Kdo-(2^8)-Kdo-(2->4)-Kdo-(2^ липид А Разветвленный тетрасахаридный кор из остатков Kdo рекомбинантного штамма Escherichia соИ, включающего ген gseA бактерии С. psittaci 6ВС, который кодирует Kdo-трансферазу, является гибридом, содержащий каждый из двух линейных трисахаридов, характерньк для диких штаммов каждой из этих бактерий [75]: Kdo-(2->8)-Kdo-(2-^4)-Kdo-(2-> липид А Kdo-(2^4)-l

Внутренний кор представителей Enterobacteriaceae имеет характерный общий структурный элемент, состоящий из двух остатков Kdo и трех остатков Hep: Нер'"-(1-^7)-| ХЬ >1 I Внешний кop-X2->.3)-Hep"-(l-^3)-Hep^-(l-^5)-Kdo'-(2->липид А Kdo -(2-»4)-' У бактерий этого семейства вьщеляют две группы структур кора, отличающиеся заместителями XI и Х2 при остатках Hep' и Hep". В первую группу, называемую сальмонельным типом, кроме самого рода Salmonella, входят имеющие сходное стр

На сегодняшний день строение кора исследовано у пяти штаммов Citrobacter: С. youngae 04 и 036 [77], С. werkmanii 027 [78], C.freundii 023 [79] и Citrobacter sp. PCM 1487 [80]. Кор Citrobacter входит в сальмонельную группу, и на основании изучения продуктов мягкой кислотной деградации ЛПС для его внутренней области установлено следуюшее общее строение: Х2-7-Нер'"-(1->7)-| Внешний кор->3)-Нер"-(1->3)-Нер'-(1->5)-Kdo X1-4-I Коры всех исследованных штаммов содержат дифосфоэт

8.2. Род Erwinia Одна полная и одна частичная структуры кора установлены для штаммов Е. carotovora PERM Р-7576 [82] и В374 [83] соответственно. Кор первой бактерии содержит фосфатную группу в положение 4 остатка Hep', и, таким образом, относится к несальмонельному типу. Его особенностью является дисахаридная внешняя область и присутствие в нестехиометрическом количестве остатков p-Gal и Hep'", образующих боковую цепь. Gal-(P 1 -^6)-Нер'"-( 1 ->7)-| Kdo"-(2->4)-| G

Строение кора Е. соИ изучается уже более 30 лет, и 2 на сегодня накоплено большое количество данных о его особенностях. Установлено пять структурных типов кора Е. соИ, называемых типами R1-R4 и К-12. На основании серологических данных, полученных с помощью кроличьих поликлональных антисывороток, специфичных к различным типам кора, было предположено существование кора смешенного типа R1R4 у штамма Е. соИ 1502 [84], однако позднее было показано, что этот кор относится к типу R1 [85]. Общее стро

8.4. Род Hafnia Исследование продуктов мягкого кислотного гидролиза ЛПС целого ряда штаммов Hafnia alvei позволило установить следующую углеводную основу кора, первоначально считавшуюся общей для всего вида: Нер'"-(1^7)-| Glc"-(1^3)-Glc'-(l-^3)-Hep"-(l->3)-Hep'-(l->5)-Kdo X1-J U-PPEtn В большинстве штаммов кроме дифосфоэтаноламина при Hep' кор содержит также фосфатную группу в положении 4 остатка Hep" (XI = Р-4), а в штамме Н. alvei 1211 вместо нее на этом ост

8.5. Род Klebsiella Кор К. pneumoniae не входит в сальмонельную группу, и его внешняя область присоединяется к остатку Hep в положение 3 остатком GalA. Типичным для К. pneumoniae является отсутствие фосфатных групп во внутренней области кора и присутствие остатка Kdo во внешней области. В обобщенном виде строение кора К. pneumoniae можно представить следующим образом: Х2-(1-^7)-Нер'"-(1->7)-| Kdo"-(2->4)-| XЗ-(l->4)-Kdo"^-(2->6)-GIcN-(l->4)-GalA-(l->3)

Бактерии Proteus характеризуются структурной вариабельностью кора от штамма к штамму и существованием различных структурных вариантов кора в одном и том же штамме. В качестве общего структурного элемента во внутренней области кора подавляющего большинства изученных штаммов содержится 4-амино-4-дезокси-Р-Ьарабиноза (P-L-Ara4N), присоединенная к остатку Kdo': Х2-(1^7)-Нер"'-(1-^7)-| r(2<-4)-Kdo" X4-(l->4)-GalA-(l->3)-Hep"6Xl-(l-^3)-Hep^-(l->5)-Kdo^-(2->липидA ХЗ-(

Изучено строение кора только одного штамма Р. shigelloides 054:Н2, относящегося к несальмонельному типу [123]: Нер'"-(1->7)-| r(4<-ip)-Gal Gal-(P 1 ^4)-GlcN-(l -^4)-GalA-(l ->3)-Нер"-(1 -^3)-Нер'-(1 ->5)-Kdo Glc-(pl^6)-l Glc-(Pl->2)-l Кор не фосфорилирован, и часть его молекул не содержит терминального остатка P-GIc внешней области. Положение 4 этого остатка является местом присоединения 0-полисахарида [123].

8.8. Род Salmonella Обобщенно строение кора S. enterica, сходство с которым является критерием для разделения коров энтеробактерий на две группы, можно представить следующим образом: Нер'"-(1-^7)-] Xl-Kdo"-(2->4)-] ХЗ-(1->2)-01с"-(1-»2)-Оа1-(1->3)-ШсЧ1->3)-Нер"-(1-»3)-НерЧ1->5)-КаоЧ2->липидА Gal-(l->6)-' P-l X2-P-4-I В корах S. enterica svs. minnesota и typhimurium остаток Kdo" замещен в положение 4 третьим остатком Kdo [XI = Kdo'"-(2

8.9. Род Shigella Кор Shigella имеет заметное структурное сходство с кором Е. соИ, что соответствует генетической близости этих бактерий. Так, кор S. sonnei и S. flexneri 6 имеет сходное строение с кором Rl-типа Е. соИ [135-137]: Х2-(1->7)-Нер'"-(1->7)-| Gal-(l->2)-Gal-(l->2)-Glc"-(l->3)-Glc'-(l-»3).Hep"-(l->3)-Hep'-(l->5)-Kdo Glc"-(pl^3)-l X1-4-J U-PPEtn Для всех изученных Shigella штаммов показано присутствие дифосфоэтаноламина при остатке Hep

S.W. Тол Serratia Структурное исследование ЛПС S-штамма S. marcescem IFO 3735 и R-мутанта 111 показало, что кор S. marcescens относится к несальмонельному типу, но имеет некоторые особенности замещения остатка Kdo' [23]: Нер'"-(1->7)-| г(2<-4)-Х1 Внешний кор -(1-»3)-Нер"-(1-»3)-Нер'-(1-^5)-Као'-(2->липид А P-Glc-(l->4)-' '-(8<_1).Х2 Так, заместителем в положении 4 Kdo' является либо остаток Kdo", как у большинства энтеробактерий, либо остаток В-г/7мг/еро-0-7иа/г

8.11. Род Yersinia Кор Yersinia, как и кор Serratia, принадлежит к несальмонельному типу и имеет следующее общее строение: Х2-(1-^7)-Нер'"-(1->7)-| г(2<-4)-Х1 Х4-(Р 1 ->3)-Нер"-( 1 ^3)-Нер'-(1 ->5)-Kdo^-(2->липид А ХЗ-(1->2)-1 L(4<_l)-p-GIc Дополнительно эти два рода бактерий сближает способность варьирования заместителя в положении 4 остатка Kdo", выявленная при исследовании кора возбудителя чумы Y. pestis (XI = Kdo или Ко). В этом коре варьируется

Строение кора исследовано только у одного штамма F. tularensis АТСС 29684 [149]. Кор этой бактерии не содержит остатков Hep, не фосфорилирован и имеет следующее строение: r(3<-l)-Glc 0-антиген-(Р 1 ->4)-Мап-(Р 1 ->4)-Мап-(1 ->5)-Кёо-(2->липид А GalN-(l->2)-J L(2<_i)-p.Glc Олигосахариды кора, содержащие фрагмент Man-(l->5)-Kdo были найдены также у бактерий Legionella pneumophila [150-152], Rhizobium [54] и некоторых других [31].

Наиболее изученным в отношении строения кора является Н. pylori [29;30;153-158]. Полный кор этого вида содержит общий структурный элемент, построенный из остатка Kdo, двух остатков Hep, двух остатков Hep* и трех гексоз: Х1,Х2-Нер*"-(1->2)-| r7-PEtn Glc"-(1 -^3)-GIc'-(l ->4)-Gal-(P 1 ->7)-Нер*'-(1->2)-Нер"-(1 -^3)-Нер'-(1 ->5)-К(1о-(2->липид А Заместитель в положении 4 остатка Kdo неизвестен, но наиболее вероятно, что им является второй остаток Kdo. Остаток He

Установлено строение кора L. pneumophila серогруппы 1, относящегося к Нер-несодержащим корам [150-152]: GIcNAc-(l->6)-| L-Rha-(1 -^3)-L-Rha-(l ->3)-QuiNAc-(P 1 -»4)-GlcNAc-(P 1->4)-Мап-( 1 ->5)-К(1о'-(2->липид A Ac-4-l Ac-4-l Ac-4-l Ас-З-^ Man-(l->8)-Kdo"-(2->4)-l Также как кор Francisella tularensis [149] и Rhizobium etli [54], он включает дисахаридный фрагмент Man-(l->5)-Kdo'. Дисахарид такого же состава Мап-(1—>8)-Kdo" образует боковую цепь внзоренней о

2.2.

12.1. VojK Acinetobacter Установлено четыре различных типа структур кора Acinetobacter, ни один из которых не содержит остатков гептозы [18;19;31;76;163]. Кор Acinetobacter sp. АТСС 17905 и А. haemolyticus АТСС 17906 характеризуется заменой в части молекул остатка Kdo, соединяющего кор с липидом А, остатком Ко [18; 19]: АТСС 17905 Glc-(1 ->6)-Glc-(P 1 ->3).Gal-(P 1 ->7)-Kdo-(2^4)-K(d)o-(2-> липид A GIc-( 1 ^6)-Glc-(P 1 ->4)-Glc-( 1 ->5) J Kdo-(2->4)-K(d

2.2.

Изученными в отношении строения кора являются находящиеся в R-форме ЛПС N. meningitidis [168-177] и N. gonorrhoea [178-183], а также одного штамма N. sub/lava [184]. Кор этих бактерий содержит тетрасахарид из двух остатков Hep и двух остатков Kdo, хотя для некоторых штаммов замещение остатка Kdo' в положение 5 не подтверждено, а присутствие остатка Kdo'' продемонстрировано только для некоторых штаммов N. meningitidis [175; 177; 185] и N. subjlava АА [184]. В коре N. gonorrhoeae 302 описано пр

2.2.

Установлено строение олигосахаридов кора различных щтаммов Я. influenzae [189205] и Н. ducreyi [206-208], которые содержат общий структурный фрагмент из трех остатков Hep, одного остатка Kdo и одного остатка глюкозы. Обобщенно строение кора Я. influenzae можно представить следующим образом: Х4-(1->3)-| r(4<-l)-p-Glc-X3 X5-Hep"'-(l-»2)-Hep"-(l->3)-Hep'-(l->5)-Kdo-(2^ липид А X2-4-I PEtn-6-l U-X1 Как показано на примере нескольких штаммов [189;193;209;210], остаток Kdo фо

Кор двух изученных штаммов Histophilus somni (ранее Haemophilus somnus) значительно отличается по структуре от кора бактерий рода Haemophilus [214;215]. Вопервых, остаток Kdo в коре Н. somni не фосфорилирован, а замещен вторым остатком Kdo, и, во-вторых, во внутренней области кора присутствуют не три, а только два остатка Hep: |-(4<-l)-p-GIc-Xl X2-Hep"-(1^3)-Hep'-(l->5)-Kdo-(2-> липид А • l-(4<-2)-Kdo Остаток P-Glc в коре патогенного штамма Н. somni 738 содержит в положении 6

Олигосахарид кора М. haemolytica (ранее Pasteurella haemolytica) серотипа Al имеет строение, сходное с кором Я. influenzae и Я. ducreyi; в частности, он включает общий структурный элемент из трех остатков Hep и одного остатка Kdo, фосфорилированого в положение 4 [31;216]: P-Gal-(l->7)-Hep*-(l->6)-Hep*-(l->6)-p-Glc-(l->4)-| Hep"'-(l->2)-Hep"-(1^3)-Hep'-(l->5)-Kdo-(2-^ липид А Glc-(1^6)J U-P Как и в коре Я. ducreyi, заместитель в положении 6 остатке P-Gl

2.2.

Для кора изученных бактерий семейства Pseudomonadaceae характерным является кор с внутренней областью, содержащей по два остатка Kdo и Hep: Cm-7-| г4-Р r(2<-4)-Kdo" Внешний кор ->3)-Hep"-(l->3)-Hep'-(l-»5)-Kdo'-(2-> липид А Р-6-1 I-2.X1 Остаток Hep' бисфосфорилирован в положения 2 и 4 (XI =

Р) [1;218-221], а в коре большинства изученных штаммов Р. aeruginosa в положении 2 находится остаток дифосфоэтаноламина (XI = PPEtn) [4;222]. В отличие от первоначальной лок

2.2.

16.1. Роя Agrobacterium Строение кора установлено для единственного представителя рода Agrobacterium бактерии А. larrymoorei, содержащей ЛПС в R-форме [225]. Кор не содержит гептоз и не фосфорилирован, а остаток Kdo' гликозилирован в положение 4 остатком Kdo": РОСОИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА P-GlcAN-(l->3)-p-Glc-(l-^4)-| p-QuiЗNAcyl-(l-^2)-L-Rha-(l->4)-GalAN-(l->6)-Gal-(l->5)-Kdo^-(2->липидA Kdo"-(2^4)-l Во внешней области кора присутствует остаток 3-амино-3,6

К настоящему времени установлено полное строение кора R. etli [53;54] и частичное строение кора некоторых биоваров R. leguminisarum [48-52;52;22б;227]. Кор R. etli имеет следующую структуру [54]: GalA-(1^4)-| Man-(l->3)-QuiNAc-(l->4)-Kdo^"-(2->6)-Gal-(l->6)-Man-(l->5)-Kdo'-(2->липидA GaIA-(l ->4)-Kdo"-(2-^4)-' GalA-(l-^5)-l Одной из уникальных особенностей этого кора является замещение остатка Kdo" двумя остатками GalA. Третий остаток GalA присоединяется к

2.2.

17.1. Род Vibrio Строение кора V. cholerae исследовано у двух штаммов каждой из серогрупп 01 [228] и 0139 [229-231] с ЛПС в S- и R-форме, а также у серогруппы 022 [231;232] и штамма НИ [233;234], В серогруппах 0 1 , 0139 и 022 обнаружено сходное строение кора, включая фосфорилирование в положение 4 единственного остатка Kdo, присутствие четырех остатков Hep и терминального остатка фруктофуранозы (Fru/): Нер'^-(1->6)-| r(6<-l)-GIc GlcN-(l ->7)-Нер"'-( 1 -»2)-Не

Заключение Состав и структуры бактериальных ЛПС отличаются широким разнообразием. Липид А является наиболее консервативной частью ЛПС, 0-антигенный полисахарид гладких штаммов - наиболее вариабельной, а олигосахарид кора сочетает в себе как [238] [237] [239] консервативные, так и вариабельные элементы структуры. Моносахаридным компонентом кора, общим для ЛПС всех грамотрицательных бактерий, является 3-дезокси-0-л<анно-окт-2-улозоновая кислота (Kdo) или другая, близкая ей по структур

Существует несколько схем классификации штаммов Р. aeruginosa, основанных на 0-антигенах (соответствие между некоторыми из них приведено в таблице

3.1,1). В Западной Европе и США наиболее употребительной является Международная система типирования антигенов (Interaational Antigenic Typing System, lATS) [242;243], в которую входит 20 простых 0-серогрупп. В Восточной Европе используется классификационная схема Лани-Бергана [244], включающая 31 О-серотип в составе 13 простых и сложных 0-сер

3.2.1. Выделение ЛПС ЛПС R-типа вьщеляли из сухих бактериальных клеток шероховатого клинического изолята от больного муковисцидозом экстракцией смесью фенол-хлороформ-петролейный эфир по методу Галаноса [246], после удаления органических растворителей ЛПС осаждали водой из фенольного раствора и очищали диализом. ЛПС S-типа получали из сухих бактериальных клеток типовых гладких штаммов Р. aeruginosa экстракцией 45% водным фенолом при 65-68° по методу Вестфаля [247] и очищали осаждением сопутст

Для установления строения ЛПС использовалась комбинация двух различных методов деградации ЛПС, применение каждого из них приводило к продуктам, сохраняюпщх значительную часть структурной информации при потере некоторой другой ее части.

3.2.

2.1. Жесткая щелочная деградация ЛПС 0-дезацилировали мягким гидразинолизом и затем N-дезацилировли жесткой щелочной обработкой [248]. Такая двухступенчатая деградация позволяла избежать Р-элиминирования в присутствующих в липиде А 3-ацилоксиацильных группах с образованием ненасыщенных жирных кислот, отщепляющихся труднее, чем насыщенные кислоты. При этом из ЛПС R-типа из шероховатого клинического изолята Р. aeruginosa образовались олигосахариды, представляющие собой фосфорилированную углевод

Для определения моносахаридного состава олигосахаридных продуктов по деградации ЛПС использовали ГЖХ-анализ ацетатов полиолов, получаемых соединения для последующей локализации 0-ацетильных групп с помощью спектроскопии ЯМР стандартной методике [251]. Содержание гептозы и галактозамина, определяемое этим методом, было заниженным по сравнению с их содержанием, которое следовало из структур олигосахаридов, установленных методами МС и спектроскопии ЯМР. В случае гептозы эта трудность объяснялас

Масс-спектрометрия отрицательных ионов с ионизацией электрораспылением (МС ИЭР) использовалась для определения молекулярных масс продуктов деградации ЛПС, что давало информацию об их составе, а также о природе и степени гетерогенности. Сравнительный анализ масс-спектров олигосахаридных смесей, полученных при деградации ЛПС различных серогрупп, позволял выявлять сходные структуры и выбирать соединения с новыми структурами для более детального исследования. Увеличение ионизирующего потенциала в

2192

3.3.

1.1. Жесткая щелочная деградация Первый из исследованных нами ЛПС выделен из клинического изолята Р. aeruginosa 2192, который, как и другие изоляты от больных муковисцидозом, является шероховатым штаммом с ЛПС R-типа. Щелочную деградацию ЛПС проводили как до, так и после частичного дефосфорилирования, что позволило провести поэтапное отнесение спектров ЯМ? сначала менее фосфорилированных, а затем более фосфорилированных соединений. ЛПС был 0-дезацилирован мягким гидразин

1.2. Мягкий кислотный гидролиз ЛПС был расщеплен мягким кислотным гидролизом при рН 4,2. Анализ состава полученного олигосахарида кора ОС2192-З показал, что он содержит рамнозу, глюкозу и гептозу в соотношении 1:3,4:0,3 наряду с галактозамином и аланином в соотношении 1,2:1 и следовыми количествами этаноламина. Дефосфорилирование OC2i92"3 привело к заметному увеличению содержания гептозы в гидролизате (Rha:Glc:Hep 1:3,5:1,0 соответственно). Спектры ЯМР показали значительную структурную г

3.3.2. Серогруппа О-10 Серогруппа О-10 включает два серотипа О-10а, 10b и 0-1 Оа, 10с. Повторяющиеся звенья их 0-полисахаридов имеют одинаковое строение углеводной основы и отличаются только присутствием 0-ацетильной группы в положении 2 остатка L-Rha в ЛПС серотипа О-10а,10Ь [245;257;258]: О-1 Оа, 1 Ob O-10a,10c -)-3)-L-GalNAc А-( 1 ->3)-QuiNAc-( 1 ->3)-L-Rha-( 1 -> l-2-OAc ->3)-L-GalNAcA-(l->3)-QuiNAc-(l->3)-L-Rha-(l-» где QuiNAc обозначает 2-ацетамидо-2,6-дидезокси-0-глю

2.3. Масс-спектрометрический анализ липида А и полная структура ЛПС Исследование методом МС ИЭР отрицательных ионов (рис.

3.3.

2.6.) липида А, выделенного при мягкой кислотной деградации ЛПС серотипа О-10а, 10b, показало соответствие его структуры лит. данным [259-261]. '•'б-'рон он ЛА„

1196.776

1094.576 2ОИ12:0 ЮН.60< ЛА^ри

1098.619

1430.870 ЛАтетра

1276.734

1292.740

1462.863 ЗОН10:0 ^"пвнта

1446.867

1632.992 ЗОН10:

3.3.3. Серогруппа 0-12 Ранее было установлено следующее строение химического повторяющегося звена 0-полисахарида Р. aeruginosa 0-12 [245;262]:

->3)-QuiN Ас-(Р I -»8)-8eLeg5 Ас7 Ac-(2->3)-L-FucNAm-( 1 -> где FucNAm обозначает 2-ацетимидоиламино-2,6-дидезоксигалактозу и 8eLeg5Ac7Ac 5,7-диацетамидо-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-глмг/е/7о-0-га77акто-нон-2-улозоновую (производное 8-эпилегионаминовой кислоты).

3.3.

3.1. Жесткая щелочная деградация Жесткая щелочная деградация ЛПС

6 В серогруппу 0-6 входят четыре серотипа 0-ба, 0-6а,6Ь, 0-6а,бс, 0-6a,6d и иммунотип 1 (Fisher), Все ЛПС этой серогруппы исследовались ранее в отношении строения О-полисахарида, и было установлено следующее строение химических повторяющихся звеньев [245;263-265]: 0-ба 0-6а,6Ь 0-6а,6с ->4)-GalNAcA-( 1 ->4)-GalNFoA-( 1 ->3)-QuiNAc-( 1 -»3)-L-Rha-( 1 -> АсО-З-! '-6.NH2 ->4)-GalNAcA-( 1 ->4)-GalNFoA-( 1 ->3)-QuiNAc-( 1 ->2)-L-Rha-( 1 -> NHz-e-l AcO-3-l Lg-NHa -10% ^4)-

3.3.5. Серогруппа 0-13 Серогруппа 0-13 включает два серотипа 0-13а,13Ь и 0-13а,13с, для которых ранее были установлены следующие структуры химических повторяющихся звеньев 0-полисахаридов [245;267;268]: О-1 За, 1ЗЬ 0-13 a, 13 с ->4)-GalNAcA-(l ->3)-QuiNAc-(p 1 ->2)-L-Rha-( 1 ->2)-L-Rha-( 1 -> U-OAc -30% ->4)-GalNAcA-( 1 ^3)-QuiN Ac-(p 1 ->2)-L-Rha-( 1 ->2)-L-Rha-( 1 -> Glc-(l-»3)-l Эти два 0-полисахарида отличаются присутствием остатка глюкозы в качестве бокового за

3.3.6. Серогруппа O-l Особенностью 0-полисахарида P. aeruginosa 0-1 является присутствие 2,3-диацетамидо-2,3-дидезоксиглюкуроновой кислоты (GlcNAc3NAcA) наряду с GalNAc, QuiNAc и FucNAc, образующих тетрасахаридное химическое повторяющееся звено следующего строения [245;269]:

->4)-GlcNAc3NAcA-(pi->3)-FucNAc-(l-»3)-QuiNAc-(l->4)-GalNAc-(l->

3.3.

6.1. Жесткая щелочная деградация ЛПС Жестким щелочным гидролизом ЛПС серогруппы 0-1 с последующей хроматографией на геле

В серогруппу 0-7 входят три серотипа со следующим строением химических повторяющихся звеньев 0-полисахаридов [245;270-272]: 0-7а,7Ь,7с 0-7a,7b,7d 0-7a,7d ->3)-FucNAc-(P 1 ->4)-Pse5(3HOBu)7Fo-(2->4)-Xyl-(P 1 -> U-OAc ^3)-FucNAc-(|31->4)-Pse5Ac7Fo-(2->4)-Xyl-(pl-> U-OAc ->3)-FucNAc-(P 1 -)-4)-Pse5Ac7Fo-(2->4)-Xyl-(P 1 -> где Pse обозначает 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-г7М1/е'/70-Ь-л1Ш/но-нон-2-улозоновую (псевдаминовую) кислоту, Fo формильную группу, ЗНОВи (

В серогруппу 0-9 входят серотипы 0-9a,9b,9d и 0-9a,9d, химические повторяющиеся звена 0-полисахаридов которых имеют следующее строение [245;273]: 0-9a,9b,9d 0-9a,9d Необычной присоединение ^3)-QuiNAc-(P 1 ->3)-3HOBu-7)-Pse5 Ac-(p2->4)-FucNAc-(a 1 -> U-OAc -)-3)-QuiNAc-(pl^3)-3HOBu-7)-Pse5Ac-(p2->4)-FucNAc-(al-> особенностью 0-полисахаридов этой серогруппы группе является (ЗНОВи), остатка QuiNAc к (К)-3-гидроксибутаноильной ацилирующей аминогруппу в положении 7 остатка псевда

В серогруппу 0-4 входят два серотипа 0-4а,4Ь и 0-4а,4с. Химические повторяющиеся звенья их 0-полисахаридов имеют следующее строение [245;274]: 0-4а,4Ь 0-4a,4c ->2)-L-Rha-( 1 ->3)-L-FucNAc-( 1 ->3)-L-FucNAc-( 1 ^3)-QuiNAc-(P 1 -> ->2)-L-Rha-(l->3)-L-FucNAc-(l->3)-L-FucNAc-(l->3)-FucNAc-(Pl-> Единственное отличие между двумя серотипами заключается в замене остатка QuiNAc в 0-полисахариде 0-4а,4Ь на остаток FucNAc в 0-полисахариде 0-4а,4с.

3.3.

9.1. Мягкий

3.3.10. Серогруппа O-ll Серогруппа 0-11 включает два серотипа 0-11а, И b и 0-11а,11с, однако структурное исследование не выявило различий между их 0-полисахаридами, имеющими следующее строение химического повторяющегося звена [245;275;276]:

->3)-L-FucNAc-( 1 ->3)-FucNAc-(P l->2)-Glc-(p 1 -> Было найдено, что в серогруппе 0-11 (IATS 0-11) моносахаридом, заверщающим биосинтез повторяющегося звена, является остаток глюкозы [277], и, следовательно, первым моносахаридом является

В серогруппу 0-3 входят три серотипа 0-За,ЗЬ, 0-За,ЗЬ,Зс и 0-3a,3d. Химические повторяющееся звенья соответствующих 0-полисахаридов имеют следующее строение [245;278]: 0-За,ЗЬ 0-3a,3b,3c 0-3a,3d где ->6)-GIcNAc-(l->4)-L-Ga!NAcA-(l->3)-QuiNAc4N(3HOBu)-(pl->2)-L-Rha-(l-> -40% OAc-3-l -^6)-GlcNAc-(l->4)-L-GalNAcA-(1^3)-QuiNAc4N(3HOBu)-(Pl->2)-L-Rha-(l->-40% OAc-3-l -40% OAc-3-l ->6)-GlcNAc-(l->4)-L-GaINAcA-(l->3)-QuiNAc4NAc-(pl-)-3)-L-Rha-(l-> обозначает 2,4-д

Серогруппа 0-2, являющаяся самой больщой из сложных серогрупп Р. aeruginosa, включает щесть серотипов 0-2а,2Ь, 0-2а,2Ь,2е, 0-2а,2с, 0-2a,2d, 0-2a,2d,2e, 0-2a,2d,2f и иммунотип 7. Химические повторяющиеся звенья 0-полисахаридов серогруппы 0-2 имеют следующее строение [245;279-285]: 0-2а,2Ь 0-2a,2b,2e 0-2a,2c 0-2a,2d 0-2a,2d,2e 0-2a,2d,2f иммунотип 7 ->4)-ManNAc3NAmA-(p 1 ->4)-ManNAc3NAcA-(p 1 ->3)-FucNAc-(p 1 -> ->4)-ManNAc3NAmA-(P 1 ->4)-ManNAc3NAcA-(P 1 ->3)-FucNAc-(p 1

Клетки клинического изолята Р. aeruginosa от больного муковисцидозом 2192, выращенные на питательном соевом бульоне, были любезно предоставлены профессором Пайером (Лаборатория Чэннинга, Гарвардская медицинская школа. Бостон, США). Музейные типовые штаммы Р. aeruginosa 170014 (0-1), 170003 (0-2a,2b), 170004 (0-2а,2с), 170005 (0-2a,2d), 170007 (0-2a,2d,2f), Wokatsch 14 (0-3a,3b), 170001 (0-3a,3b,3c), 170021 (0-4a,4b), 170040 (0-4a,4c), 170041 (иммунотип 1), 170012 (0-7a,7b,7d), 170019 (0-9a,9d

5.2.1. Выделение ЛПС R-типа Сухие тонкоизмельченные клетки Р. aeruginosa 2192 суспендировали в водном 90% феноле (30 мл водного фенола на 10 г клеток) в ультразвуковой бане при 50° в течение 4 ч, затем добавляли хлороформ и петролейный эфир до объемного соотношения растворителей 90% фенол/хлороформ/петролейный эфир 2:5:8 и перемешивали на 16 ч при 20°. Клетки отделяли центрифугированием (5000 об-мин"', 10 мин) и экстрагировали такой же смесью растворителей еще дважды по 30 мин. Об

Полисахарид или олигосахарид (0,3

мг) растворяли в 2 М CF3CO2H (0,3

мл) и гидролизовали в герметично закрытом контейнере 2 ч при 120°. Раствор упаривали в токе воздуха, гидролизат восстанавливали свежеприготовленным щелочным раствором NaBH4 (0,3 мл; 10 мг NaBH4 в 1 мл 1 М ЫЩОН) в течение 2 ч при 20°. Избыток NaBH4 нейтрализовали концентрированной уксусной кислотой, упаривали досуха в токе воздуха, остаток упаривали с 10% раствором уксусной кислоты в метаноле и трижды с метанолом.

Олигосахарид (0,2

мг) растворяли в 4 М НС1 (0,2

мл) и гидролизовали в герметично закрытом контейнере 16 ч при 100°. Аминокомпоненты анализировали в виде фенилизотиоцианатных производных с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Pico-Tag (150x3,9 скорости 1 мл-мин"

мм) с использованием в течение стандартных буферов Pico-Tag для аминокислотного анализа белковых гидролизатов («Waters», Германия) при 42° и 10 мин; контроль осуществлялся с помощью ультрафиолетового детект

5.7.1. Гель-проникающая хроматография Хроматографию на геле Sephadex G-50 (S) («Pharmacia», Швеция) проводили на колонке (60 X 2,5

см) в 0,05 М пиридин-ацетатном буфере рН 4,5 (10 мл уксусной кислоты и 4 мл пиридина в 1 л воды) или на колонке (40 х 2,6

см) в 0,1 М NH4HCO3 (7,91 г NH4HCO3 и 10 мг NaNs в 1 л воды) при скорости потока 40 мл-ч'*. Контроль за элюцией осуществлялся с помощью дифференциального рефрактометра («Knauer», Германия).

5.7.2. Газо-жидкостная хромат