Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Получение и изучение свойств олигомерных форм неорганической пирофосфатазы Escherichia coli : Активация пирофосфатом : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10

Год: 2002

Номер работы: 343806

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

. Гексамерная РРаза Е. coli относится к первому семейству РРаз, состоит из шести идентичных субъединиц, и может рассматриваться как димер тримеров. Два тримера расположены в параллельных плоскостях и повернуты друг относительно друга на 24°. Каждая субъединица состоит из 175 аминокислотных остатков и имеет активный центр, который образован нерегулярными участками полипептидных цепей. В гидролизе PPj принимают участие три - четыре иона металла; два иона с разным сродством присоединяются к ферм

2.2. Конфирмационные перестройки фермента. Согласно данным ренгеноструктурного анализа, молекула РРазы Е. coli пронизана сетью нековалентных взаимодействий, поэтому связывание лигандов в активном центре приводит к конформационным изменениям молекулы фермента. Действительно, ранние исследования РРаз показали, что связывание ионов металлов приводит к изменениям в УФ-спектрах и спектрах флуоресценции, что может быть использовано для определения констант диссоциации [25]. Дальнейшие исследования

. Пируватдекарбоксилаза (ЕС

4.1.

1.1; PDC), являющаяся ключевым ферментом в анаэробном метаболизме многих организмов, катализирует превращение пирувата в ацетальдегид. Тиаминдифосфат (ThDP) является кофактором фермента вместе с ионом магния. Пируватдекарбоксилаза является одним из наиболее изученных ThDPзависимых ферментов. Цикл реакций декарбоксилирования представлен на рис. 3 [46]: Атака карбаниона ThDP (структура

1) по 2-кетогруппе пирувата приводит к образованию 2-лактил

. Ацетилхолинэстераза (ЕС

3.1.

1.7; AChE) и бутирилхолинэстераза (ЕС

3.1.

1.8; BuChE) являются сериновыми эстеразами, принадлежащими одному семейству. AChE играет основную роль в терминировании действия нейромедиатора ацетилхолина. Этот фермент гидролизует ацетилхолин с очень высокой скоростью. Для BuChE точной физиологической роли не выяснено, однако полагают, что этот фермент участвует в функционировании нервной системы. BuChE человека имеет также важное фармакологич

. Фенилаланингидроксилаза (фенилаланин-4-монооксигеназа, ЕС

1.14.

16.1; РАН) катализирует превращение фенилаланина до тирозина. Превращение фенилаланина в тирозин является скорость-лимитирующей стадией в катаболизме фенилаланина. Отсутствие каталитической активности или пониженный ее уровень у человека приводит к такому заболеванию как фенилкетонурия, поэтому вопросы регуляции активности фермента всегда были в центре внимания исследователей. Реакция гидроксилирования протекает в п

4.1.Характеристика гексамерных форм Glul45Gln, Asp26Ala и Ad-WT РРаз.

4.1.1. Седиментадионный анализ. Поскольку замена аминокислотного остатка вблизи области контакта между субъединицами может влиять на состояние олигомерной структуры РРазы, необходимо было охарактеризовать четвертичную структуру исходных белков. Коэффициенты седиментации мутантных вариантов РРазы и модифицированного фермента, определенные методом скоростной седиментации, приведены в таблице 2. Таблица 2. Коэффициенты седиментации нативной и модифицированных РРаз. РРаза WT Glul45Gln Asp26A

4.1.2. Сродство ионов магния в центре низкого сродства (М2) в модифицированных вариантах РРазьг Известно, что РРаза может связывать в активном центре четыре иона магния, два из которых связываются с ферментом в отсутствие субстрата в центрах высокого и низкого сродства. Активной формой фермента является его комплекс с двумя ионами металла [1]. Центр высокого сродства заполняется при очень низких концентрациях ионов металла, и константу диссоциации ионов металла в этом центре точно определить

. При изучении кинетических свойств мутантного варианта Asp26Ala РРазы и AdWT РРазы обнаружилось, что их кинетическое поведение не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен и носит сложный характер, поэтому свойства гексамерных форм этих ферментов будут описаны отдельно. Для гексамерной формы Glul45Gln РРазы были определены рН-независимые параметры гидролиза MgPPj при 5 мМ Mg^"^ в широком диапазоне значений рН. Кажущиеся значения каталитической константы и константы Михаэлиса рассчитывали

. Выдерживание РРазы в слабокислой среде при 20°С приводит к превращению гексамерной молекулы в тримеры [38]. В этих условиях происходит разрушение ионных контактов между тримерами. Инкубация гексамера при рН 5,3 сопровождается быстрым падением активности фермента (рис. 15). ' ' ' — 1 1 ' 1 — / / - • — I — ^ о 40 60 80 Время, мин 160 Рис.15. Диссоциация \\^Т РРазы до тримеров при рН 5,3 (1) и ассоциация тримеров в гексамер при рН 7,5 (2). Условия определения активности: 50 мМ Тп8-НС1,

4.2.2. Получение димерных форм нативной РРазы и ее мутантных форм, количественная характеристика процесса. Для разрушения гидрофобных взаимодействий, участвующих в контактах мономеров в составе тримеров в гексамерной молекуле, изменяли полярность среды. Для этого к раствору РРазы при рН 7,5 добавляли изопропиловый спирт до 20% от общего объема. Наблюдаемое падение ферментативной активности отражает превращение гексамера в димер (рис. 20). Доказательства образования димера основываются

4.2.3. Доказательство строения димера; мономерная форма РРазы. Образование димеров из гексамера можно представить двумя различными путями: либо за счет распада всех межсубъединичных контактов в тримерах и сохранения межтримерных контактов (условно такой димер может быть назван «двухэтажным»), либо за счет распада тримера до димера и мономера (образование «одноэтажного» димера). Принципиальным отличием двух типов димеров должно быть их отношение к воздействию слабокислой среды, нарушающей ио

4.3. Изучение кинетических свойств олигомерных форм нативной и модифицированных РРаз.

4.3.1. Кинетические свойства тримерной формы фермента, схема активации гидролиза субстрата (•MgPPj) пирофосфатом. Изучение кинетики тримера нативного фермента при рН 7,5 и 1-5 мМ М^^* показывает, что его поведение не может быть описано уравнением Михаэлиса-Ментен (рис. 25). Это хорощо видно из представления данных в двойных обратных координатах и выражается в отсутствии линейности данных в указанных координатах. Причин такого поведения может быть несколько. Во-первых, такое поведение могло

. Очевидно, что, согласно схеме 2 эффекторный центр должен существовать и в гексамере нативного фермента. Кинетику гидролиза субстрата гексамерными формами нативной РРазы и ряда мутантныч форм изучали неоднократно в широком диапазоне концентраций субстрата и ионов магния и никогда не наблюдали отклонений от уравнения Михаэлиса-Ментен. Причиной этого является, видимо, очень высокое сродство пирофосфата к эффекторному центру. Вследствие этого он оказывается заполненным эффектором при использу