Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Синтез нейтральных неогликолипидов для создания модульных систем доставки нуклеиновых кислот : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10

Год: 2013

Номер работы: 2099

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Определение физико-химических характеристик катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК

2.3.

1.2. Изучение цитотоксичности катионных липосом и доставки с их помощью плазмидной ДНК

2.3.2. Выбор адресного модуля для МЛТС, нацеленных на асиалогликопротеиновый рецептор

2.3.

2.1. Определение физико-химических характеристик адресных МЛТС

2.3.

Изучение агглютинации адресных МЛТС в присутствии лектина RCA120 3. Экспериментальная часть

3.1. Основные методы

3.2. Синтез связывающих модулей МЛТС

3.2.1. Синтез монокатионных амфифилов

3.2.2. Синтез поликатионного амфифила

3.3. Синтез адресных модулей МЛТС

3.3.1. Синтез моновалентных неогалактолипидов

3.3.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов

3.3.

2.1. Синтез гидрофобных и углеводных предшественников

3.3.

Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе L-Glu

3.3.

2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе 1,3-диаминопропан-2-ола

3.3.

2.3. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе спермина

3.4. Биологические исследования Выводы Список литературы 67 71 72 73 80 80 81 81 85 87 87 88 88 96 110 115 119 123 124 Список сокращений BGTC - бисгуанидин-трен-холестерин Con А - лектин конканавалин А COSY DC-Choi - ЗР-[7^-(Л^,Л^-диметиламиноэтил)карбамоил]холестерин DMRIE - rac-N- [2,3 -ди(терадецилокси)проп-1 -ил] -7У-(2-гидроксиэтил)-]Ч Nдиметиламмоний бромид DOGS - диоктадециламидо-7У-(6-спермилкарбонил)глицин DOPE - 1,2-

Генная терапия сравнительно новый метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний, направленный на устранение генетических дефектов или придания клеткам новых функций [1, 2] за счет введения в них терапевтических нуклеиновых кислот (НК) (трансфекция). Биофармацевтические препараты на основе НК могут контролировать развитие болезни на уровне активации или ингибирования действия генов, ответственных за ее развитие. В качестве терапевтических НК могут выступать плазмидные ДНК, антисмыс

с участием катионных липосом Метод доставки НК в составе комплексов с КЛ называется липофекцией и включает несколько этапов, суммарно определяющих эффективность всего процесса трансфекции. Для осуществления липофекции клеток необходимо приготовить комплексы НК и катионных липосом, которые образуются за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженной группой КА и отрицательно заряженной фосфатной группой НК. В результате такой спонтанной самоассоциации в наноразмерные липо

для доставки нуклеиновых кислот Модульная липидная транспортная система (МЛТС) для доставки НК представляет собой самособирающийся транспортный контейнер, построенный из различных не связанных ковалентно липофильных модулей и запрограммированный на выполнение определенных функций связывание и защиту НК, нацеленность на клетки-мишени, эффективное высвобождение НК из эндосом и транспорт в ядро [19, 20]. Такие МЛТС удачно описывает концепция Л.ВС.О-наночастиц (рис.

2) [20]. Рисунок

Первым модулем системы доставки, который определяет ее эффективность, являются катионные липосомы. Как правило, катионные липосомы конструируют из КА и липидахелпера. Липид-хелпер оказывает важное влияние на структуру и свойства липоплексов, улучшая эффективность доставки. Так, было показано, что липосомы, состоящие из КА и цвиттер-ионного фосфолипида DOPE (1,2-диолеоил-£л-глицеро-3-фосфоэтаноламин), приводят к более эффективной доставке ДНК, чем липосомы на основе только КА [22-24]. DOPE

Схематичное представление структуры катионных амфифилов Каждый из доменов вносит свой вклад в активность молекулы КА и определяет ее поведение в организме. Гидрофобный домен участвует в формировании упорядоченных липидных структур, катионный - связывает молекулы НК, а спейсерная группа обеспечивает подвижность катионного и гидрофобного доменов в пространстве. Большое значение имеет линкерная группа, так как ее устойчивость определяет токсичность молекулы амфифила в биологических системах [30

Вторым модульным компонентом, способным защищать МЛТС от инактивации в биологических жидкостях, являются липофильные производные полиэтиленгликоля (ПЭГ). ПЭГ создает стерический барьер вокруг липоплексов, тем самым, предотвращая ретикуло- взаимодействие с компонентами крови и захват липоплексов клетками эндотелиальной системы [34]. Существуют три основных подхода к созданию транспортных систем, содержащих ПЭГ. В первом подходе липофильное производное ПЭГ вводится в состав катионных липосо

Третьим модулем, который может существенно улучшить эффективность транспорта НК, являются липоконъюгаты с адресными лигандами, которые способны с высокой селективностью связываться с поверхностными рецепторами клетки-мишени. Для достижения максимальной специфичности поверхностный рецептор должен более активно экспрессироваться в целевых клетках по сравнению с другими клетками организма. Связывание лиганда с узнающими его рецепторами способствует более эффективному проникновению переносимого

Класс белковых молекул, называемых лектинами, способны обратимо и избирательно связывать разнообразные углеводы как в индивидуальном виде, так и в составе Лектин-углеводные гликоконъюгатов, не нарушая ковалентной структуры последних. взаимодействия имеют огромное значение в биологии [40]. Доменные центры лектинов выступают в качестве чувствительнейших биосенсоров, детектирующих определённые углеводные последовательности в олигосахаридах, которые являются специфическими лигандами в углевод

Структура АСГПр гепатоцитов. Среди полисахаридных адресных лигандов, нацеленных на АСГПр, наиболее часто используют так называемые "асиалогликопротеины" (АГП), которые получают из ряда гликопротеинов после их ферментативной или химической модификации, приводящей к удалению остатков сиаловой кислоты и появлению терминальных галактозильных групп [46, 47]. Позднее было показано, что лигандами для АСГПр могут быть не только гликопротеины, но и другие молекулы, содержащие остатки D-гала

Для доставки НК был синтезирован амфифил 1а, который представляет собой бифункциональную молекулу, содержащую остаток галактозы для взаимодействия с АСГПр гепатоцитов и иминогруппу для связывания ДНК [51]. он он он он * B -JS£SA он он ^ОН -О ,Ь ^ЧЙЬА "•»-но^ё2нон NT NH H0\^^^S^X M A N .N ОН йн2 - N Катионные липосомы, содержащие гликолипид 1а, были нетоксичными и эффективно доставляли плазмидную ДНК в клетки HepG2, экспрессирующие АСГПр, причем трансфицирующая активность п

3.1.3). он он О Н - Л - - Ч > ^ 0 ^ ^ \ ^ \ ^ \ ^ ^ ^ ^ ^ ^ А к,, R NH 2 NH он 6а-с NH 2 N H ° н \ / \ i /\, > N/ N/ \ / \ / ч. v N/ N / v v r/^/ ^ v NH2 S NH 2 a ч N \/ N H < NH 2 b

3.1.2. Эффект мультивалентности в углеводном распознавании на примере поливалентных нейтральных гликоконъюгатов Одним из главных препятствий при гликонацеливании является низкое сродство систем доставки, несущих на себе адресные маркеры, к рецепторам. Аффинность связывания наиболее важный критерий, который необходимо учитывать при разработке нацеленных систем доставки, которые должны максимально соответствовать структуре рецептора из-за конкурирования с другими эндогенными лигандами. Моновале

3.1.3. Поливалентные гликоконъюгаты в составе липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот Основываясь на свойствах соединений ба-с для достижения «эффекта кластера» при связывании катионных липосом с АСГПр, были получены полиамины 16а-с с различным количеством остатков галактозы и исследована их способность доставлять ДНК в клетки BL-6 или HepG2, экспрессирующие АСГПр [61]. Результаты показали, что эффективность трансфекции клеток BL-6 не зависела от количества остатков галактозы

Как известно, быстро развивающиеся или недифференцированные опухоли, в отличие от нормальных тканей, имеют повышенное содержание на клеточной поверхности рецепторов фолиевой кислоты (ФК) [93, 94]. Благодаря своему небольшому размеру и коммерческой доступности ФК стала одним из наиболее используемых лигандов для направленной доставки в опухолевые клетки [95 - 97]. В 1995 году впервые было сообщено о синтезе липофильных конъюгатов ФК [98] и показано, что для эффективного связывания с рецептора

На поверхности раковых клеток в большом количестве экспонированы рецепторы трансферрина (ТФ), который представляет собой мембраносвязанный гликопротеин, осуществляющий транспорт ионов железа. Показано, что использование ТФ в качестве нацеливающего трансфекции. лиганда приводит к значительному увеличению эффективности крови была Эффективная доставка ДНК в присутствии сыворотки осуществлена с помощью липоплексов с адсорбированным на их поверхности за счет электростатических взаимодействий

1.3.4. Дополнительные функциональные модули МЛТС, увеличивающие эффективность доставки нуклеиновых кислот Открытие пептидов, способных проникать в клетку без участия мембранных белков и способных осуществлять внутриклеточный транспорт связанных с ними молекул, позволяют увеличить эффективность доставки НК. Такие пептиды, получившие название «cell из белков различных penetrating peptide» (проникающие пептиды), были выделены организмов от вирусов до позвоночных, где они выполняют разнообразны

Для повышения эффективности переноса НК проводятся модификации структуры катионных амфифилов, которые включают изменение компоновки структурных единиц и природы катионного и/или гидрофобного доменов, варьирование спейсерных и линкерных групп. В данной диссертационной работе были получены полии монокатионные амфифилы, различающиеся строением гидрофобных и катионных доменов для дальнейшего формирования МЛТС и изучения влияния структуры амфифила на эффективность доставки НК. В качестве гидрофобн

Концепция модульной липидной системы доставки НК в гепатоциты предполагает, что в состав катионных липосом включается нейтральный амфифил, несущий углеводные лиганды. Известно, что аффинность адресных МЛТС к АСГПр гепатоцитов зависит от количества адресных маркеров, экспонированных на поверхности систем доставки, а также от их пространственного взаиморасположения [61, 70, 90, 92]. В связи с этим, для выявления связи «структура - активность» нами были синтезированы адресные модули МЛТС, предст

Для синтеза бивалентных неогалактолипидов необходимо было получить наборы унифицированных структурных блоков - углеводных и гидрофобных предшественников, содержащих различные линкерные и спейсерные группы (рис.

2.6). Дальнейшая последовательность присоединения предшественников к выбранным матицам варьировалась в зависимости от типа используемой полифункциональной молекулы. Следует отметить, что такой подход к созданию неогалактолипидов позволяет легко комбинировать структурные блоки и

Гидрофобные предшественники различными спейсерными группами 17а,Ь и 18а,Ь с карбамоильным линкером и (гидрофобной и гидрофильной природы) были 1,2-ди-(9-тетрадецил-гас-глицерина 14а и получены из активированных производных холестерина 14Ь (схема 4). Для синтеза активированного соединения 14а использовали разработанный ранее подход [173], который включал взаимодействие 1,2-ди-Отетрадецилгас-глицерина с 4-нитрофенилхлорформиатом (2 экв.) в среде хлористого метилена и в присутствии избытка три

Исходными соединениями в синтезе галактозилсодержащих предшественников 23а,Ь и 24Ь служили со-хлорспирты 20а,Ь, в которые при помощи реакции гликозилирования вводили адресный лиганд - остаток D-галактозы, а затем при помощи последовательных превращений осуществляли замену атома хлора на аминои карбоксильные группы (схема 6). Гликозилирование соединений 20а,Ь 2,3,4,6-тетра-0-ацетил-а-В-галактозилбромидом (a-4AcGalBr) проводили в условиях одного из вариантов метода Кенигса-Кнорра (модификация

2.2.4. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе 1,3-Диаминопропан-2ола Синтетическая последовательность получения бивалентных неогалактолипидов на основе L-Glu, описанная в разделе неогалактолипидов преждевременному на основе

2.2.3, не может быть перенесена на синтез привела стадии бы к 1,3-диаминопропан-2-ола, углеводных поскольку на дезацетилированию остатков введения гидрофобных аминопредшественников в бивалентный кластер. Поэтому, для, получения неогалактолипидов 45a,b н