Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Разделение каталитического цикла цитохром bc1-комплекса в хроматофорах Rhodobacter capsulatus на отдельные стадии с помощью ионов цинка : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04

Год: 2005

Номер работы: 64113

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Убихинол: цитохром с оксидоредуктаза, называемая также комплексом III или цитохром 6с 1-комплексом, является ключевым компонентом энергопреобразующих электрон-транспортных цепей. Этот фермент занимает центральное место в энергетическом обмене митохондрий и большинства бактерий. У цианобактерий и зелёных растений фунцию, аналогичную цитохром Z)Ci-комплексу, выполняет цитохромный ^>^комплекс. Цитохром Ьс]-комплекс включает в себя один цитохром b с двумя гемами высокопотенциальным Zh и низкоп

1.1. Общее строение и функции цитохром 6с1-комплекса. Цитохром Z»Ci-комплексы животных и бактерий, также как и цитохром Ь^комплексы растений и цианобактерий, представляют собой олигомерные мембранные белки, функционирующие как электрогенные хинол: цитохром с/пластоцианин оксидоредуктазы (Ivanov, 1993, Berry et al., 2000a, Cramer et al., 1996). Они катализируют окисление разнообразных хинолов при помощи высоко потенциальных переносчиков электронов, таких как цитохромы с-типа в митохондриях пл

1.3. Строение и функции железносерного белка Риске. При исследовании негемовых атомов железа в цитохром 6ci-комплексе методом ЭПР (Rieske et al., 1964), был обнаружен сигнал при g = 1,90. Таким образом, был открыт ещё один переносчик электронов в дыхательной цепи. Он получил название железно-серного белка белка Риске. Белок имеет массу 21,5 кДа. Гидрофильная iV-концевая часть С С О Т из 29 аминокислотных остатков, гидрофобная часть белка, ОТИ представляющая собой а-спираль, состоит из 25 оста

1.5. Ингибиторы цитохром 6с1-комплекса. В настоящее время различают несколько групп ингибиторов цитохром bci-комплекса (Von Jagow and Link, 1986). По структуре, по месту связывания и по тому, какие реакции они блокируют, выделяют обычно три основные группы. К первой группе относятся различные Р-метоксиакрилаты, которые блокируют окисление убихинола связываясь в Qo-сайте неподалёку от гема Ь\. Ко второй группе относятся аналоги убихинола. Ингибиторы этой группы блокирз^ют окисление убихинола,

1.6. Влияние ионов цинка на цитохром 6с1-комплекс. Специфические органические ингибиторы играют важную роль в изучении электронного транспорта в цитохром ^)С1-комплексе. Однако тяжёлые металлы, например цинк, также обладают ингибирующим действием. Впервые ингибируещее действие микромолярных концентраций цинка на митохондриальные дыхательные цепи было показано Скулачёвым и соавторами (Skulachev et al., 1967). Добавление ионов Zn^"^ к митохондриям в микромолярной концентрации увеличивало

Осажденные из 2 л бактериальной культуры клетки ресуспендировали в 500-700 мл буфера 1, содержавшего: 30 мМ HEPES, 2 мМ MgCb, 50 мМ КС1, и вновь осаждали центрифугированием (12000g, 35 мин., 4 °С). Эту процедуру проделывали дважды, чтобы клетки полностью отмылись от среды роста. Затем клетки ресуспензировали в буфере 1, дополненым 10% сахарозой и добавляли несколько крупинок ДНКазы. С этого момента все процедуры с суспензией выполнялись при О "С (на льду) и в темноте. Суспензия пропускал

2.3. Измерение концентрации бактериохлорофила. Концентрация бактериохлорофила определялась спектрофотометрически по методу Клайтона (Clayton, 1973). Хроматофоры (25 мкл) растворяли в 5 мл смеси ацетон : метанол (7 : 2). Полученый раствор фильтровали и измеряли оптическую плотность при 1. = 772 нм. Коэффициент молярной экстинкции бактериохлорофила в такой среде составляет €772 ^ 75000.

. Установка для импульсной спектрофотометрии была собрана в соответствии с принципами изложеными в работе Юнге (Junge, 1976). Она описана в работе Фенюка и соавторов (Feniouk et al., 2001) Лампа Кюветное отделение Вспышка Ф и л ь т р 780нм ФЭУ Линзы Шторка Интерференционн ы й фильтр Усилитель' Осциллограф Nicolett Pro 10 Рис. 15: Схема установки для импульсной спектрофотометрии. Источником для мониторного света служила галогеновая лампа мощностью 200 Вт. Свет фокусировался дву

. При определении рН-зависимостей, следуя работам Линка и фон Ягова (Link and Von Jagow, 1995), использовались такие пиперазин-содержащие буфера, как HEPES, PIPES и EPPS. При нейтральных значениях рН концентрация буфера HEPES была равна 25 мМ, в остальных случаях концентрация буфера HEPES равнялась 50 мМ, а концентрация PIPES и EPPS - 100 мМ. Среда измерений, содержащая буфер и все необходимые компоненты, доводилась до требуемого значения рН и только потом, в кювету добавлялись хроматофоры. Д

. При регистрации изменений рН внутри хроматофоров использовались препараты, отмытые от буфера с помощью ультрацентрифугирования. Измерение рН внутри хроматофора регистрировалось с помощью амфифильного красителя нейтрального красного. Присутствие 5 мМ рН-буфера HEPES в пробе позволяло селективно регистрировать, при длине волны 545 нм, изменения оптического поглощения красителя внутри хроматофоров в ответ на выброс протонов цитохром ZJCI-комплексом.

2.8. Измерение температурной зависимости. При получении температурных зависимостей использовался термостат с термостатируемои кюветной ячейкой. Измерения проводились в пластиковых кюветах объёмом 4 мл, оптический путь составлял 1 см. Пробы инкубировались перед измерением 30-40 мин непосредственно в кюветной ячейке для уравновешивания температуры.

2.9. Приготовление пробы для изучения влияния тяжёлой воды (D2O) на цитохром bci— комплекс В опытах использовалась тяжёлая вода производства фирмы «Berk». Все водные растворы, используемые в работе, готовились на основе D2O. Хроматофоры осаждали и ресуспензировали в D2O. Состав среды измерений и методы были такие же, как описаные выше для сред содержащих Н2О.

2.10. Регистрация изменений А\|/. Изменения Д\|/ регистрировались при длине волны мониторного света 522 нм по изменению поглощения каротиноидных пигментов (Junge and Witt, 1969, Jackson and Crofts, 1969, 1971, Clark and Jackson, 1981), Установлено, что изменение поглощения каротиноидов линейно зависит от изменения А\(/ (Junge and Witt, 1968, Jackson and Goodwin, 1993). С помощью этого метода возможно регистрировать изменение A\jf в микро и миллисекундной шкале, В ответ на вспышку возбуждающе

2.11. Регистрация окислительно-восстановительных реакций в цитохроме Ь. Измерение оптического поглощения гема Ь\^ в ответ на вспышку измерялось как разность ответов на 561 нм и 570 нм. Особенность используемого в данной работе штамма Rhodobacter capsulatus BIO заключалась в том, что величина электрохромного сдвига бактериохлорофилла вкладывающегося в поглощение при 561 и 570 нм минимальна и сходна по значениям между собой на этих двух волнах. Таким образом, электрохромный сдвиг бактери

2.12. Регистрация окислительно-восстановительных реакций в цитохромах Ci и Сг. За окислительно-восстановительными превращениями в цитохромах ci и С2, следили, измеряя, разницу оптического поглощении при длинах волн 552 нм и 570 нм, т.е. А552 - А570. Цитохром сг имеет максимум поглощения при 550 нм, а цитохром с\ имеет пик поглощения при 552 нм (Meinhardt and Crofts, 1982). Из-за такого близкого расположения максимумов поглощения двух разных цитохромов значение абсорбции при 552 нм показ

2.13. Рассчет корректировочных коэффициентов. Для учета вклада электрохромного сдвига бактериохлорофилла Pgvo^ в длины волн, на которых поглощают гемы цитохрома b VL с\ измерялись индуцированые вспышкой изменения абсорбции в присутствии 5 мкМ валиномицина, который подавлял быстрое электрохромный временное сдвиг в бактериохлорофилла. Используя разрешение микросекундной шкале, можно было отличить очень быстрое образование PgTo^ от более медленных цитохромных реакций. Вклад цитохрома С\ при

. Определение концентрации фотосинтетических реакционных центров (РЦ) производилось после блокировки быстрого восстановления PgTo^ путем добавления поглощения 5мкМ миксотиазола. при Для 604 РЦ устранения нм, в вклада сдвига каротиноидов пробу по добавлялся изменению валиномицин К^. Концентрация определялась поглощения при X = 604 нм после 3-х вспышек возбуждающего света с интервалом 50 мс (Mulkidjanian et al., 1991). Коэффициент молярной экстинции брался €б04 = 22000 (Bowyer et al., 1

3.1. Характеристика окислительно-восстановительных условий во время измерений. Предварительные эксперименты показали, что ионы Zn^"^ образовывали комплексы с ферроцианидом. Это делало невозможным использование такого традиционного редокс буфера как ферроцианид/феррицианид калия. Поэтому в данной и работе соавторами мы воспользовались отработанной пары Константиновым методикой использования сукцинат/фумарат калия в качестве редокс буфера (Каменский и др., 1975). В ответ на вспыш

3.4. Зависимость редокс реакций гема bh и генерации А^ цитохром />С1-комплексом от концентрации Zn^^. Концентрационная зависимость была снята в интервале концентраций от О до 600 мкМ Zn . На рис. 26 показаны зависимости амплитуд реакций в цитохромftci-комплексеот концентрации ZnS04. в N н 1,21,1- 1,0-( 0,9-' • • п с S N В S 0,80,70,60,5- + S а 0,40,30,2- S ее 0,1 -^ 0,0^ 200 2+ УА Концентрация Zn , мкМ Рис. 26 Зависимость относительной амплитуды реакций в цитохром бсгкомплекс

3.6. Каталитический цикл цитохром ^^i-комплекса при различных значениях рН. Действие Zn на генерацию А\|/ и редокс реакции гема Ь/, и цитохрома Соб было исследовано в интервале рН от 6 до 9,5. По сравнению с обычными условиями измерений при рН 7,5, в кислых и щелочных значениях рН наблюдалось снижение ингибирующего действия Zn . На рисунке 31 (А-С) представлены кинетики этих реакций при рН = 6,0. Цинк в концентрации 50 мкМ практически не оказывал никакого влияния на генерацию Ау и окислитель

. Изменения рН внутри хроматофора в ответ на вспышку света регистрировались с помощью амфифильного рН-индикатора нейтрального красного в присутствии 5 мМ рН-буфера HEPES. Этой концентрации HEPES достаточно для подавления рН-ответов нейтрального красного в среде, омывающей хроматофоры, но недостаточно для подавления рН-ответов во внутреннем очень малом объеме хроматофора (Mulkidjanian and Junge, 1994). Добавление к пробе 3 мкМ K^/¥t обменника нигерицина снимало АрН. Таким образом, разница отв

3.8. Каталитический цикл цитохром 6с1-комплекса при разных температурах. Изучение действия Zn на генерацию А\|/, а также на окислительно- восстановительные реакции гема bh и цитохрома CQQ было проведено в интервале температур от +3°С до +40°С. В отсутствие Zn с увеличением температуры наблюдалось ускорение как генерации А\|/ (рис. 36С), так и ре-восстановления цитохрома Сдб (рис. 36В). Восстановление гема bh в присутствии антимицина А также ускорялось с увеличением температуры (рис.