Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04

Год: 2005

Номер работы: 64106

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Актуальность проблемы Одним из направлений современной иммунологии является учение об аутоиммунизации, то есть иммунных процессах, обусловленных антигенами собственных тканей (аутоантигенами), сопровождающихся появлением аутоантител (ААТ) или/и аутореактивных лимфоцитов (Christen and von Herrath, 2004). Аутоантитела - Ig, которые взаимодействуют, хотя бы с одним аутоантигеном как в норме, так и при патологии (Lacroix-Desmazes et al., 1998). Один из путей, приведших к возникновению и развитию

Системная красная волчанка (СКВ) - системное аутоиммунное воспалительное заболевание соединительной ткани неизвестной этиологии. По данным 2002 года в мире из 2000 человек 1 страдает СКВ. Начало заболевания приурочено к возрасту от 10-15 до 40-50 лет и до 90% всех больных волчанкой страдают женщины. СКВ часто прогрессирует с поражением ряда органов, что и является причиной смерти в течение 10 лет с момента установления диагноза у 28% больных. Повышенная настороженность в отношении слабовыраже

1.2. Аутоантитела к ДНК

В 1957 г., используя методы непрямой иммунофлюоресценции и фиксации комплемента, в нескольких лабораториях мира в сыворотках крови больных СКВ были впервые обнаружены ААТ к ДНК (Ceppellini et al., 1957; Holborow et al., 1957; Robbins et al, 1957). Аутоантитела - Ig, которые взаимодействуют хотя бы с одним аутоантигеном (антигеном собственных тканей) как в норме, так и при патологии (Lacroix-Desmazes et al., 1998). ААТ к ДНК удалось определить и у животных с волчаночноподобными заболеваниями.

1.2.2. Биологическая роль аутоантител кДНКв норме и патогенезе СКВ Вопрос о биологических функциях «естественных» ААТ к ДНК, обнаруживаемых в норме, пока остаётся без ответа. Pisetsky (1997), основываясь на экспериментальных данных, высказал предположение о том, что ААТ к ДНК в норме играют важную роль как первоначальный элемент в защите организма от чужеродной ДНК (вирусов и бактерий). Кроме того, «естественные» ААТ могут способствовать удалению аутоантигенов (продуктов метаболизма) до увели

Для изучения патогенетических (генетических, иммунологических) механизмов, вносящих вклад в развитие заболевания, и определения стратегии лечения часто используются неаутоиммунные и экспериментальные мышиные модели СКВ, с признаками, характерными для СКВ человека, в том числе увеличение уровня в крови ААТ к нДЬЖ. Основные мышиные модели СКВ (спонтанные, индуцированные, трансгенные) и их характеристика описаны в ряде обзорных статей (Stoll and Gavalchin, 2000; Nguyen et al., 2002). В основном

1.2.4. Иммунохимические свойства патологических аутоантител к ДНК Исследованиями многих авторов показано, что в норме у человека и мыши концентрация сывороточных изотипов IgG и IgM и единообразный репертуар аутореактивности «естественных» ААТ постоянны и стабильны на протяжении всей жизни (Lacroix-Desmazes et al., 1998; Lacroix-Desmazes et al., 1999; Marchalonis et al., 2002). Отмечено, что репертуар реактивности IgG к чужеродным антигенам среди здоровых лиц, напротив, отличается высокой гете

Так как различия между патологическими и непатологическими ААТ к нДНК на молекулярном уровне, возможно, очень малы, то структурный анализ бесценен для идентификации этих различий. Кроме того, знание о молекулярной структуре ААТ к нДНК важно для понимания механизмов распознавания аутоантителами как ДНК, так и перекрёстно-реагирующих молекул, и, соответственно, вклада этих ААТ в патогенез СКВ. Данные о структуре ААТ к ДНК к настоящему времени получены, в основном, в исследованиях моноклональных

1.2.6. Взаимодействие аутоантител с ДНК Каким же образом ААТ к ДНК способны распознавать и специфично связывать антигенные детерминанты в молекуле ДНК? Этот вопрос до сих пор остаётся малоизученным. Некоторыми авторами показано, что у многих исследованных ААТ к ДНК (мыши и человека) способность взаимодействовать с ДНК присуща тяжёлой цепи, в основном за счёт VH-CDR3, а лёгкая цепь может увеличивать, снижать или полностью блокировать это взаимодействие, а также приводить к распознаванию допо

В исследованиях последнего двадцатилетия открыта новая функция AT - способность катализировать различные химические и биохимические реакции, то есть выступать в роли биологических катализаторов. По аналогии с энзимами такие катализаторы получили название абзимы (от англ. antibody enzyme) или каталитические антитела. Изучение антител, обладающих ферментативной активностью - каталитических антител (КАТ), или абзимов одно из новых направлений, возникших в последние годы развития иммунологии, мол

Вопрос о механизмах действия абзимов пока остаётся малоизученным. Большинство опытов в области КАТ было проведено и проводится с моноклональными AT. Это позволяет значительно упростить исследования механизма катализа абзимами. Результаты, полученные с применением моноклональных AT, являются основой для изучения ферментативной активности поликлональных индуцированных и природных Ig. Данные по индуцированным абзимам проанализированы в ряде обзоров (Щуров, 1997; Невинский и др., 2000а; Hilvert,

Основные механизмы генерации абзимов к настоящему времени хорошо изучены в экспериментах с моноклональными AT. Однако возможность их реализации и причины возникновения природных абзимов в условиях поликлонального (ауто)иммунного ответа представляются неодинаковыми. 1. КАТ могут вырабатываться по пути, аналогичному для искусственных абзимов, индуцированных аналогами переходных состояний, когда какойлибо нативный или частично изменённый собственный компонент организма (ДНК, РНК, нуклеопротеид,

Вопрос о биологической роли природных абзимов пока остаётся открытым. Так как появление всех типов обнаруженных аутоабзимов сопряжено, как правило, с аутоиммунными реакциями, то абзимы, вероятно, могут являться дополнительным звеном в развитии патологического процесса и могут служить важным клинико-диагностическим показателем вида и стадии заболевания. С другой стороны, напротив, образование КАТ может являться запрограммированным компенсаторным механизмом и ААТ участвуют в элиминации аутоагре

Получение гомогенных препаратов природных абзимов с высокой активностью является одной из самых сложных проблем. Кроме того, что в крови содержатся поликлональные AT, состоящие из большого числа Ig, имеющих сродство к различным антигенам, необходимо учитывать тот факт, что природные абзимы могут иметь различное происхождение и их взаимодействие с каким-либо иммобилизованным субстратом может отличаться на порядки. Таким образом, при очистке абзимов на первых стадиях необходимо отделять AT от а

1.3.6. Нуклеазная активность природных каталитических антител Нуклеазная акгивность AT (Д1Жи РНК-гидролизующая) сыворотки крови классов IgG и IgM изучается при аутоиммунных заболеваниях (СКВ, аутоиммунном тиреоидите, полиартрите, рассеянном склерозе и др.), лимфопролиферативных, некоторых вирусных заболеваниях (СПИДе, различных формах вирусного гепатита - заболеваниях, протекающих с нарушением иммунного статуса), онкологических и спонтанных мышиных моделях СКВ, в основном, двумя группами росс

Для изучения ДНК-гидролизующих AT и их предполагаемого механизма действия используются различные методы: электрофорез ДНК в агарозном геле, метод линейного дихроизма, электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДНК-субстрат. Однако эти методы позволяют определять только конечные продукты реакции гидролиза ДНК-абзимами, а не промежуточные, и отсутствует возможность получать информащ1Ю о взаимодействии AT с ДНК. В 1986 году Binnig и др. (1986) был изобретён атомно-силовой микроскоп (АСМ),

Приведённые выше данные литературы свидетельствуют о том, что характерной особенностью тяжёлого аутоиммунного заболевания неизвестной этиологии - системной красной волчанки - является повышенный уровень содержания в сыворотке крови больных AT к нДНК класса IgG, определение титра которых имеет важное прогностическое и диагностическое значение. Среди этих AT к нДНК были обнаружены AT, которые обладают ДНКгидролизующей активностью. Изучению как ДНК-связывающих, так и ДНК-гидролизующих AT посвяще

Ниже приведены сведения об использованном оборудовании и реактивах. 1. Колонка для гель - фильтрации диаметр

1.6 см, высота

30.5 см 2. Колонка для гель - фильтрации диаметр 1,6 см, высота 31 см Pharmacia (Sweden) 3. Колонка стеклянная для ионообменной и аффинной хроматографии, диаметр

1.5 см, высота 12 см 4. Колонка для аффинной хроматофафии диаметр 11 см, высота 7 см 5. Перистальтический насос Р-1 6. Коллектор фракций Multirac 2111 7. Холодильная камера MiniColdLab 2203 8.

Объектом изучения служили полученные из медицинских учреждений г. Казани сыворотки крови 4 клинически здоровых доноров и 7 первично выявленных больных СКВ (5 женщин в возрасте от 17 до 52 лет и 2 мужчин - 48 и 62 года). Группу больных СКВ составили лица, находящиеся в острой фазе с различной степенью тяжести заболевания и на момент забора крови не получавших лечения преднизолоном. Диагноз СКВ подтверждался клинически.

Свежесобранную кровь из локтевой вены (в количестве 10

мл) выдерживали в термостате при +37°С в течение

1.5 ч. Образовавшийся сгусток аккуратно отделяли от стенок пробирки, обводя его спицей. Кровь инкубировали при +4°С в течение 2-3 часов для ретракции сгустка. Сыворотку декантировали и центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин. Супернатант ещё раз центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин для полного удаления оставшихся клеток. Полученную сыворотку (надосадочную жидкость) р

Набухшим и отмешированным гелем акрилекс Р-6 заполняли колонку для гель-фильтрации (высота столба геля 27 см). Колонку уравновешивали буфером А при скорости потока 40 мл/час. Для оценки качества наполнения гелем и определения свободного объёма колонки по хроматографическому профилю при 280 нм на верхний слой геля наслаивали 1 мл голубого декстрана (молекулярная масса 2000000

Да) с юзнцентрацией 2 мг/мл (Остерман, 1985). Препарат AT с сульфатом аммония наносили на колонку с акрилексом Р-

ДЭАЭ-целлюлозу заряжали и регенерировали согласно Остерману и Кочетову (Остерман, 1985; Кочетов, 1971). Стеклянную колонку для ИОХ заполняли суспензией ДЭАЭ-целлюлозы в буфере А при скорости 40 мл/ч до высоты столба геля

10.5 см. Колонку промывали 10-кратным объемом буфера А. Раствор AT после обессоливания наносили на юзлонку с ДЭАЭ-целлюлозой (15-20 мг белка) при скорости потока 10 мл/ч. Колонку промывали стартовым буфером А от несвязавшегося с анионообменником белка (IgG) до величины

Для

ою)нчательного вьщеления AT к нДНК из полученных после ИОХ фракций было необходимо подобрать нДНК-сорбент. При приготовлении аффинных сорбентов использовали два варианта закрепления ДНК на матрице: ютвалентный и некюваленгный. Количество связавшейся с носителем нДРЖ определяли по разнице внесенной и смывшейся в процессе приготовления сорбента нДНК. Степень депротеинизации препарата нДНК эритроцитов цыплят, использованного в работе, оценивали по отношению оптических плотностей раство

2.6.1. Ковалентная посадка нДНКэпоксиактивацией на носители и заполнение колонок

2.6.1.а. ДНК-целлюлоза Посадку нДНК на микрокристаллическую целлюлозу проводили согласно реьюмендациям Остермана (1985), Moss и др. (1981). Эпоксиактивацию матрицы проводили эпихлоргидрином в течение 18 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании на качалке с поддержанием рН~

11.0 титрованием 2М NaOH. Суспензию эпоксиактивированной целлюлозы и фрагментированной продавливанием через иглу шприца раствора нДНК в Na-боратном буфере (

0.038 М тетрагидроборат Na, рН

Посадку нДНК на сефарозу 2В проводили согласно Остерману (1985). Эпоксиакгивацию сефарозы проводили эпихлоргидрином на качалке с постоянным поддержанием рН~

11.0 титрованием 2М NaOH в течение 16 часов при 1«)мнатной температуре. Посадку фрагментированной нДНК на активированный носитель проводили в течение 42 часов при комнатной температуре с постоянным перемешиванием на качалке. Несвязавшуюся нДНК отмывали водой, Naборатным и Na-ацетатным буферами и блокировали непрореагировавшие эпокси

2.6.2. Нековалентная посадка нДНКна носители и заполнение колонок Посадку нДНК проводили по методу Litman (1968) с небольшими модификациями.

2.6.2.а. ДНК-целлюлоза микрокристаллическая Приготовленную микрокристаллическую целлюлозу смешивали с раствором нДНК до конечной концентрации ДНК 2 мг/мл. К высушенной ДНКцеллюлозе добавляли 96% этанол с последующим облучением УФ-лампой на расстоянии 5 см от источника света на льду на качалке до полного испарения спирта. Полученный сорбент промывали 1мМ NaCl, переводили в буфер Б и заполняли колонку диаметром

1.5 см до высоты геля 5 см при сюзрости 15 мл/час. Для удаления несвязавшейся

1г сухой ДЭАЭ-целлюлозы смешивали с раствором нДНК до конечной концентрации 2 мг/мл. К высушенному сорбенту добавляли 96% этанол и подвергали ультрафиолетовому облучению при постоянном перемешивании на льду до полного испарения спирта. нДНК-целлюлозу промывали 1мМ NaCl, переводили в буфер Б и заполняли колонку диаметром

1.5 см до высоты геля

8.0 см при скорости 40 мл/ч. Колонку промывали последовательно буферами: Б; 1 М NaCl в буфере Б; Gly-HCl; Gly-NaOH, до оптической плотности

На 1«)лонки с нДНК-носителями наносили

0.25,

0.5,1мг AT фракции I после диализа в буфере Б и профетой при +57°С в течение 45 мин при скорости потока 10 мл/час. Для осуществления полной посадки AT на нДНК сорбента прекращали ток жидкости в колонке на

0.5 часа. Белки, не взаимодействующие с сорбентом, отмывали буфером Б до полного исчезновения оптического поглощения при 280 и 260 нм. AT, связавшиеся с сорбентом, элюировали 1 М NaCl в буфере Б.

На колонку для аффинной хроматографии с нДНК-целлюлозой, приготовленной в соответствии с п.

2.6.2.а. (

1.5 смхЮ.З см), содержащей -

39.4 мг нДНК, наносили

2.1-

5.0 мг AT фракции I или фракции II, подвергнутых предварительной температурной обработке при +57°С в течение 45 мин. Для максимальной посадки AT на нДНК сорбента ток жидкости в колонке прекращали на

0.5 часа. Далее шлонку последовательно промывали при скорости 10 мл/ч до нулевых значений оптической п

Гомогенность препаратов IgG на каждой стадии их очистки исследовали с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза (Laemmli, 1970; Остерман, 1981). Электрофорез проводили на установке для вертикального электрофореза, используя 8% рабочий и

4.5% концентрирующий гели, которые готовили с использованием 30% раствора акриламида, содержащего 0,7% М,К'-метиленбисакриламид. Рабочий гель содержал

0.375 М трис-НС1-буфер, рН

8.8,

0.1% Ds-Na, концентрирующий гель -

0.125 М трис-НС1, рН<

Значения р1 препаратов IgG исследовали с помощью ИЭФ на приборе Multiphor (Остерман, 1983;Ригетти, 1986). На поверхность 5% ПААГ (125x125мм) для диапазона рН 5-7, пластинку с которым помещали гелем вверх на охлаждающий столик ч-Ю^С (для отвода выделяющегося при ИЭФ тепла), аккуратно накладывали полоски фильтровальной бумаги (5x10мм) для внесения образцов белюэв (10-20 мкл с концентрацией

0.5-

10.0 мг/мл). Во избежание неблагоприятного воздействия экстремальных значений рН расстоян

Оценку уровня содержания и взаимодействия AT в исследованных сыворотках и пробах с нДНК изучали методом ИФА в модификации, предложенной Саттаровой и др. (1994). В качестве антигена при постановке ИФА использовали нДНК из эритроцитов цыпленка или тимуса телёнка (Е260/Е280 =

1.86-

1.88), которую разводили в

0.1 М фосфат-

0.05 М нитратном буфере, рН

5.0 (ЦБ) до концентрации 10 мкг/мл и вносили по 100 мкл на лунку полистиролового планшета, который был подвергнут пред

В качестве антигенов использовали нДНК из эритроцитов цыплят, дДНК, которую получали из нДНК методом тепловой денатурации, и нДНК, модифицированную АФК (АФК-ДНК). Для получения АФК-ДНК водный раствор нДНК в ФСБ (

0.5 мг/мл) инкубировали в 1 мл при +37°С в течение

1.5 ч в присутствии

193.3 мкМ Н2О2,

10.75 мкМ аскорбата,

17.9 мкМ Fe(II),

35.8 мкМ ЭДТА с последующим диализом против Н2О в течение 24 ч при +4°С с периодической сменой Н2О (Udenfriend et al., 1954

Для объективной оценки результатов ИФА, полученных в разное время, данные исследованных образцов сывороток и проб сводили к общему знаменателю и выражали в относительных единицах - х,. Для этого во всех экспериментах анализировали одну и ту же положительную сыворотку СКВ с высоким содержанием AT к нДНК, обозначенную как «стандарт». , . . ОПла-у исследуемого образца хАотн. ед.) = ^^^ —— ОЯ492 " стандарте!' Из полученных данных в относительных единицах для каждого исследуемого образца вычи

С использованием серийного разведения коньюгата (1:50-1:32000) на ФСБТ определяли уровень содержания AT к нДНК в «стандартной» сыворотке СКВ. Оптимальное рабочее разведение коньюгата выбирали на линейном участке кривой титрования, где наблюдались максимальный уровень ответа реакции ИФА (ОП492 не менее

0.8 оптических единиц) и нулевое значение неспецифического связывания южьюгата с полистиролом при максимальном его разведении.

2.11. Выделение плазмидной ДНК pBR-322 При исследовании ДНКазной активности AT к нДНК в качестве антигена использовали плазмидную ДНК pBR-322.

Рост бактерий и амплификацию плазмидной ДНК pBR-322, содержащейся в штамме Е. соИ НВ101, проводили по методике из монографии Маниагиса и др. (1984) в среде LB (Лурия - Бергани): 1% пептон,

0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, рН

7.5, содержащей ампициллин в концентрации 40 мкг/мл. Амплификацию проводили хлорамфениколом до конечной 1юнцентрации в культуре 170 мкг/мл.

2.11.2. Выделение и очистка плазмидной ДНКpBR-322 Выделение и очистку ДНК плазмиды pBR-322 из клеток Е. соИ после амплификации осуществляли при 0°С и +А°С методом щелочной экстракции без ультрацентрифугирования. Плазмидную ДНК окончательно очищали от белков и РНК методом гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-4B (

1.6x31 см, высота столба геля 26 см), уравновешенной буфером TES (20 мМ трис-НС1, рН

7.8,

0.1 М NaCl, 5 мМ ЭДТА) при скорости потока 30 мл/ч (Маниатис и др., 19

2.11.3. Оценка резул ьтатов Так как выделение и очистка плазмидной ДНК - многоэтапный процесс, то на каждой стадии выделения и очистки отбирали по 10 мкл для электрофоретического наблюдения. В качестве юзнтрольных маркёров использовали ДНК с известной молекулярной массой: ДНК фага Я,, плазмидная ДНК риС19, pBR-322. Концентрацию нуклеиновых кислот оценивали спектрофотометрически и электрофоретически.

2.12. Гидролиз ДНК плазмиды pBR-322 антителами к ДНК

2.12.1. Изучение зависимости ДНК-гидролизующей активности антител от рНреакционной среды Реакционная смесь (10 мкл) содержала 25 мМ трис-НС1-буфер, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCb,

0.5 мМ ЭДТА, рН от

5.0 до

9.8, 20 мкг/мл плазмидной ДНК pBR-322 (содержащей 60-70% суперскрученной формы ДНК) и

0.1 мг/мл IgG после аффинной хроматографии на нДНК-целлюлозе. После инкубации в течение 17 часов при +37°С пробы моментально замораживали в морозильной камере на льду при -20°С для предотвра

2.12.2. Оценка влияния ионов двухвалентных металлов на активность антител к ДНК Антитела гидролизовали суперскрученную ДНК pBR-322 в реакционной смеси объёмом 10 мкл при +37°С в течение 15 часов. Реакционная смесь содержала 25 мМ трис-НС1-буфер, рН

7.5, 50 мМ NaCl,

0.5 мМ ЭДТА,

2.5-

10.0 мМ катионов металлов, 20 мкг/мл ДНК pBR-322 и

0.1 мг/мл AT к нДНК. Реакцию останавливали моментальной заморозкой,

2.12.3. Подбор оптимальных концентраций активных форт кислорода и оценка их влияния на активность антител к ДНК Реакционная смесь содержала: 25 мМ трис-НС1-буфер, рН

7.5, 5 мМ MgCb, 20 мкг/мл плазмидной ДНК pBR-322. Реакцию начинали добавлением АФК,

0.1 мг/мл препаратов AT к нДНК. Во время инкубации при +37°С из реакционных смесей отбирали аликвоты по 10 мкл в определённые временные интервалы в течение 1 - 20 ч и для остановки генерации АФК добавляли перехватчик электронов - КзРе(

Гидролиз pBR-322 плазмидной ДНК и ДНК эритроцитов цыплёнка антителами к ДНК сывороток крови здоровых и больных СКВ людей, после обессоливания, ионообменной и аффинных хроматографии осуществляли в реакционной смеси, содержащей 25 мМ трис-НС1-буфер, рН

7.5, 5 мМ MgCb, (или 25 мМ трис-НС1-буфер, рН

7.5, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCb,

0.5 мМ ЭДТА) 20-75 мкг/мл плазмидной ДНК pBR-322 (содержащей 60-80% суперскрученной формы ДНК) или 20 мкг/мл ДНК эритроцитов цыплёнка. Реакцию начинали до

Значения величин Р'тах» -^М» ^cat> ^ с а / ^ М ОПрСДеЛЯЛИ С ПОМОЩЬЮ МСТОДОВ Михаэлиса-Ментена, двойных обратных координат (Лайнуивера-Берка), ИдиХовсти и «прямого графика» Эйзенталя и Корниш-Боудена (Варфоломеев и Гуревич, 1999; Келети, 1990) с использованием программы Prism 4. Реакционная смесь содержала 25 мМ трис-НС1-буфер, рН

7.5, 5 мМ MgCb, 4-80 мкг/мл плазмидной ДНК pBR-322 и

0.16 мг/мл AT к нДЬЖ (изменение шнцентрации субстрата) или 20 мкг/мл ДНК pBR-322 и

0.04-

В качестве контролей использовали исходную плазмидную ДНК pBR-322 и ДНК эритроцитов цыплёнка, инкубированную при +37°С в соответствз^ощих опытным образцам условиях, но без AT, или не подвергавшихся инкубации. ДНК-гидролизующую способность AT к ДНК оценивали по превращению суперскрученной Д1Ж плазмиды pBR-322 в кольцев)ао и линейную формы. Оценку результатов гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 осуществляли методом электрофореза в агарозном геле, флуоресцентной спектроскопией и атомносиловой микро

2.13. Электрофоретический анализ плазмидной ДНК pBR-322 в агарозном геле Проведение электрофореза осуществляли согласно рекомендациям Маниатиса и др. (1984) и Кузнецовой (Кузнецова и Винтер, 1997). Электрофорез проводили в горизонтальном

0.7% агарозном геле, приготовленном на ТВЕ (трис-боратный) буфере (

0.089 М трис-борат,

0.089 М борная кислота,

0.002 М ЭДТА, рН

8.0-

8.2). Перед проведением электрофореза в исследуемые пробы добавляли

1.0 мкл

0

Измерение флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК проводили на флуоресцентном спектрофотометре. Возбуждение флуоресценции проводили светом с длиной волны 365 нм, запись флуоресценции в 1 см кювете при длине волны 600 нм. К 2 мл раствора ЭБ (1мкг/мл) в 10 мМ трис-НС1-буфере, рН

7.8, 20 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА при +4°С добавляли аликвоты реакционных смесей, содержащие

1.5 мкг ДНК (Винтер, 1980). После инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин производили запись флуоресценции.

Перед микроскопированием исследуемые пробы разводили 25 мМ трисНС1-буфером, рН

7.5, 5 мМ MgCli до конечной концентрации

0.125-

1.0 мкг/мл ДНК эритроцитов цыплёнка,

2.5-

5.0 мкг/мл плазмидной ДНК или 25 мкг/мл AT. 2 Мкл исследуемого образца наносили на свежесколотую пластинку слюды (1x1 см), инкубировали 3-5 мин при комнатной температуре, промывали 1 мл бидистиллированнои деионизованнои стерильной воды и высушивали на воздухе, а далее над силикагелем.

Визуализацию ДНК и AT проводили в полуконтактном режиме на воздухе при комнатной температуре. Параллельно с измерением топографии поверхности (высоты) также фиксировались изменения амплитуды колебаний кантилевера. Сканирование проводили с разрешением 512x512 точек. Обработку АСМ изображений (вычитание постоянного наклона, устранение искажений, связанных с неидеальностью сканера, усреднение по строкам) и определение размеров сканированных объектов проводили с помощью программного обеспечения д

Некоторые аутоиммунные заболевания связаны с появлением в крови больных большого количества ДНК-связывающих и ДЬЖ-гидролизующих AT, поэтому вероятность обнаружения природных вариантов AT к нДНК в сыворотках крови этих больных является наибольшей. Одной из особенностей больных СКВ является повышенный уровень в их крови содержания AT против нДНК Ig класса G, которые и ответственны за поражение и разрушение органов и тканей. Этот факт послужил отправной точкой поиска у пациентов с СКВ AT к нДНК,

Для получения препаратов IgG, содержащих AT к нД1Ж, на первой стадии выделения использовали осаждение Ig из сыворотки крови сульфатом аммония. После осаждения IgG сульфатом аммония AT обессоливали гельфильтрацией на акрилексе Р-6, которая даёт возможность получать гомогенные препараты AT сыворотки с минимальными потерями. КРОВЬ СЫВОРОТКА (NH4)2S04 ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ НА АКРИЛЕКСЕ Р-6 ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ посадка препарата ФРАКЦИЯI градиентная элюция ФРАКЦИЯ II АФФИНН

3.1.2. Фракционирование антител к нативнойДНК методом аффинной хроматографии на ДНК-сорбенте Заключительным этапом очистки и фракционирования AT к нД1Ж по степени сродства к нативной ДНК является аффинная хроматография на нДНК-сорбенте (рис. 2).

В основе аффинной хроматографии лежит биоспецифическое взаимодействие AT к ДНК с молекулами ДНК, иммобилизованными на нерастворимом но- 85 старт - кольцевая ДЬЖ - суперскрученная ДНК Рис. 8. Электрофоретический анализ ДНКазной активности IgG, полученных ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, после инкубации с плазмидной ДНК pBR-322 1 - плазмидная ДНК pBR-322 (контроль) 2 - ДНК, инкубированная при +37°С без AT 3 - ДНК, инкубированная с пиком AT ФРАКЦИИ I 4-7 - ДНК, инкубированная с п

3.1.26. Фракционирование антител к нДНК На рис. 10 приведён типичный профиль фракционирования IgG-AT на нДНК-целлюлозе. Элюцию AT к нДЬЖ, связавшихся с нДНК-целлюлозой и различающихся по степени сродства к сорбенту, проводили последовательно буферами: содержащим 1М NaCl, рН

7.5 (субфракция

а) и 0,1М глицин-НС1 буфером, рН

2.3 (субфракция б). Данные о процентном распределении содержания белка в полученных препаратах AT к нДНК приведены в табл. 2. Таблица 2. Количественное соо

3.2. Исследование ДНК-гидролизующей активности антител к ДНК Известно, что активность большинства ферментов зависит от условий проведения эксперимента: состава реакционной смеси, рН, времени инкубации и т.д. Для выяснения возможного механизма катализа антителами к нДНК и их роли в организме необходимо сравнить ДНК-гидролизующую активность полученных AT к нДНК с описанными в литературе свойствами ДНКаз (ферментов и ДНК-абзимов), Такое сравнение также позволит получить дополнительные аргументы

3.2.L Изучение влияния состава инкубационной среды на ДНК-гидролизуюшую активность антител к нДНК Влияние рН на скорость реакции в большинстве случаев обусловлено тем, что протон или гидроксил-ион могут принимать непосредственное участие в реакции, или при отщеплении/присоединении протона может изменяться реакционная способность участников катализа. рН может влиять на скорость ферментативной реакции тремя способами, воздействуя на: максимальную скорость; образование фермент-субстратного компл

3.2.2. Изучение влияния активных форм кислорода на активность антител к нДНКиДНКаз сывороток крови больных СКВ В литературе накапливаются данные о повышенном содержании в различных органах и тканях (почки, кровь) у больных СКВ активных форм кислорода (АФК), которые так же как и AT к нДНК могут принимать участие в содержание кольцевой ДНК, % -iNJOJ^OlCnNOOCOO о о о о о о о о о о о -^N)W•^CnCЛ^C»^DO О О О О О О О О О О О 0Q к d а* а 1 В• п I- 2 2 S " ^ N 3 < П + п о -1 tn со

3.2.3. Кинетические характеристики реакции гидролиза плазмидной ДНКpBR-322 антителами к нДНК Чтобы более полно охарактеризовать ДНК-гидролизующую активность AT к нДНК мы исследовали термодинамические и кинетически параметры гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 антителами четырёх субфракций. Так как при расчете каталитических констант любым графическим методом существует фундаментальная ошибка определения, вытекающая из самого характера этих методов (Келети, 1990), то для более точного определения

3.2.4. Изучение гидролиза плазмидной ДНКpBR-322 антителами к нДНК Сравнение кинетики гидролиза Д1Ж плазмиды pBR-322 IgG-антителами к нДНК разных субфракций показало (рис. 22, 23, внесение одной порции AT одновременно), что AT гидролизуют ДНК в течение 12-15 ч. При дальнейшей инкубации достоверных количественных конформационных изменений ДНК не происходит. Как следует из наших результатов, все исследуемые субфракции IgG-AT к ДНК не гидролизуют всю суперскрученную ДНК даже при длительной инкуба

3.3.1. Подбор и оптимизация методики приготовления образцов ДНК для А СМ При исследовании биообъектов важную роль в получении качественного АСМ-изображения играет приготовление образцов. Универсальной методики приготовления образцов пока не существует, поэтому использование какойлибо методики определяется спецификой задач. Процедура подготовки образцов для АСМ заключается в их иммобилизации на ровной подложке. Материал подложки можно варьировать в зависимости от поставленных задач. Традиционн

3.3.2. Подбор и оптимизация параметров сканирования молекул ДНК и обработка полученных изобралсений Сканирование молекул ДНК и AT, иммобилизованных на слюде, проводили полуконтактным методом на воздухе. При использовании этого метода возбуждаются вынужденные колебания кантилевера вблизи резонанса с заданной начальной амплитудой. При приближении зонда к поверхности амплитуда колебаний уменьшается до установленной оператором величины рабочей амплитуды. Кантилевер подводится к поверхности так, ч

3.3.3. Исследование взаимодействия и активности антител к нДНКсДНК Для визуализации взаимодействия AT к нДНК с ДНК использовали различные виды ДНК: коммерческий препарат ДНК эритроцитов цыплят и L Рис. 25. Зависимость амплитуды колебаний кантилевера (нА) от расстояния между зондом и поверхностью (нм), снятая на участке слюды, свободном от молекул 1 - сила отталкивания 2 - сила притяжения и отталкивания 3 - сила притяжения ^ высота нм нм ч. Рис. 26. Пример применения математической обраб