Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71727

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

2.4 Применение Ssp DnaB мнни-ннтеииа для получения рекомбинантого энндермального фактора роста человека и исследоваиие влияния интеиновой части гибридного белка на рефолдннг целевого полинентида. 86

Глава 3. Материалы и методы. 94

3.1. Реактивы. 94

3.2. Ферменты. 94

3.3. Материалы. 95

3.4. Препараты. 95

3.5. Олигодезоксирибонуклеотиды. 95

3.6. Бактериальные штаммы. 96

3.7. Плазмидные вектора. 96

3.8. Лабораторное оборудование. 96

3.9

Введение. Получение рекомбинантных полипептидов 1-7 кДа в прокариотических системах, как правило, является довольно сложной задачей. Небольшие полипептиды являются доступной мишенью для клеточных нротеаз ввиду отсутствия жесткой третичной структуры. Суп1,ествует два способа избежать протеолитического культуральную расш;епления: секреция целевого полипептида в среду и экспрессия в составе гибридного белка. В случае секреции целевого полипептида в культуральную среду возникает проблема полн

Введение. Белковый сплайсинг представляет собой посттрапсляциопный процесс, в результате которого из белка-предшествениика удаляется фрагмент полипептидной интеин с цепи обеих (интеин), сторон а внутренний последовательности, лигируются с фланкирующие (экстеины), образованием нентидной связи (рис.

1) [2]. Внутренняя часть полипептида, удаляемая в результате белкового сплайсинга, нолучила название интеина, а наружные N- и С-концевые части — экстеинов. Процесс является автокаталитичес

1.2. Особенности нервичной структуры интеинов. Все структурные осуществления и каталитические белкового и элементы, необходимые сплайсинга, находятся для в реакции интеипа последовательности нескольких экстеиновых остатках, граничащих с участками разрезания и лигирования [2, 3], Длина всех известных на сегодня интеинов составляет 134-600 аминокислотных остатков [6]. На сегодняшний день обнаружено несколько типов иптеинов. Это канонические интеины и мини-интеины, в которых отсутствует це

1.3 Механизм белкового сплайсинга.

1.3.1 Канонический механизм белкового сплайсинга. Понимание реакций, которые лежат в основе белкового сплайсинга стало возможным благодаря открытию интеинов в ДНК-полимеразах гипертермофильных археобактерий. Вследствие эволюции этих интеинов при температурах близких к 100 °С, сплайсинг является неэффективным при температуре ниже 25 °С. Благодаря вставке кодирующей последовательности интеина из термостабильной ДНК-полимеразы GB-D из Pyrococcus sp. в одной рамке считывания между двумя инородным

1.3.2 Белковый транс-сплайсинг. Существуют природные составные интеины, способные осуществлять транс-сплайсинг. цианобактерии Первый подобный sp. интеин был обнаружен dnaE, в гене Synechocystis РСС6803 кодирующем каталитическую субъединицу ДЬЖ-полимеразы III. Ген представляет собой структуру, содержащую две отдельные рамки считывания, отстоящие друг от друга более чем на 745 т.п.о. [33, 34]. Другие природные интеины (например, Тге DnaE-3) также обнаружены в цианобактериях, имеют высокую с

1.3.4 Белковый сплайсинг в интеинах, содержащих нетипичные аминокислоты в консервативных доменах.

1.3.

4.1 Интеины, не содержащие гистидин в предпоследней позиции. Известно более 20 интеинов, содержащих в предпоследней позиции не гистидин, но другой аминокислотный остаток (чаще всего глицин, серин или аланин, а также фенилаланин) [13]. Некоторые из этих интеинов неспособны -22- к сплайсингу (ClpP из Chlamydomonas eugametos сплайсируется только носле замены нредноследнего глицина н

1.4 Факторы, влияющие иа реакцию белкового сплайсинга. Изучение белкового сплайсинга in vitro показало (на примере интеинов See VMA и Psp ро1-1), что рН близкий к нейтральному является оптимальным для реакции [1,51]. Такие условия способствуют образованию эфирной (тиоэфирной) связи на первой стадии реакции (стабилизируют тиазолидиновый интермедиат), которая, по-видимому, является лимитирующей [3, 52]. Интеины из термофильных архейных организмов претерпевают сплайсинг только при повышенных

1.5 Эндонуклеазные домены интеинов.

1.5.1 Особенности нервичной структуры. Мотивы С, D, Е, Н формируют DOD-эндонуклеазный домен, который присутствует канонических интеинах. Основная роль этого домена индукция мобильности интеиновых генов [4, 6, 10, 12]. Структура большинства DOD-доменов схожа [56] (рис.12). В середине эндонуклеазного домена две антипаралельные а-спирали (а4 и

а7) - формируют активный центр, содержащий 2 LAGLIDADG мотива - по одному на каждой а-спирали. Непосредственно с ДНК связываются по 6 аминокислотны

1.5.2. Хоуминг интеинов. «Хоуминг» - это боковой перенос встраивающихся генетических последовательностей, таких как интроны или интеины в родственный аллель в котором отсутствует данный генетический элемент. Результатом хоуминга является дупликация встраивающийся последовательности. Нроцесс инициируется сайт-специфическими эндонуклеазами которые кодируются в открытой рамке считывания с мобильными элементами. Ряд свойств этих белков делают их привлекательным объектом для структурных и фу

1.6 Распространение н эволюция интеинов. Филогенетическое наличие распределение домена интеинов случайно. Вероятно, эндонуклеазного делает возможным распространение интеинов в различных генах и организмах [6]. Интеин с активным эндонуклеазным доменом может распространяться по аллельным генам, не содержащим интеиновой вставки, следующим образом: эндонуклеаза вносит двуцепочечный разрыв в сайт узнавания и таким образом инициирует репарацию на основе интеин-содержащей копии гена. Способн

1.7 Применение белкового снлайсинга в биотехнологии.

1.7.1 Экспрессионные системы на основе ннтеннов для очистки и модификации рекомбинантных белков. Получение высокоочищенных рекомбинантных белков и пептидов является важной задачей белковой химии. Аффинная последовательность (мальтозо-связывающий белок Е. coli (МВР), глутатион S-трансфераза (GST) или полигистидиновая последовательность), присоединённая к рекомбинантному белку, облегчает его дальнейшую очистку, а также может обеспечить более высокую эффективность синтеза и стабильность гибрид

1.7.2 Реакция лигирования синтезированных белков. Метод лигирования синтезированных белков (expressed protein ligation, EPL) является модификацией реакции нативного химического лигирования (native chemical ligation, NCL), в ходе которой образуется пептидная связь между цистеином на N-конце одного пептида и С-концевым остатком другого пептида, активированным тиоэфиром [74, 75] (рис.16). Сложность химического получения пептидов с С-концевым тиоэфиром ограничивала применение NCL для белков с мол

. Имитация посттрансляционных модификаций. Получение рекомбинантных белков с сайт-специфическими посттрансляционными модификациями (такими как фосфорилирование, гликозилирование) внутриклеточной необходимо сигнализации, для детального изучения активности механизмов ферментов, регуляции взаимодействий белков с другими макромолекулами. Традиционный метод фосфорилирования рекомбинантных белков предполагает их обработку киназами. Такой подход не всегда обеспечивает высокий выход и специфичнос

1.7.3 Белковый транс-сплайсинг и применение составных интеинов в биотехнологии. Системы, описанные выше, основаны из на г/мс-сплайсинге, цепи т.е. автокаталитическом предшественника. удалении интеина единой белка- N- и С-концевые субдомены интеинов взаимодействуют независимо от центрального (эндонуклеазного) домена, что позволило разработать системы mpawc-сплайсинга. В таких системах N- и С-концевые фрагменты интеинов с прилежащими экстеинами синтезируются как отдельные полипе

1.7.4 Применение иитеннов для носттрансляционной активации белков. Большое число клеточных модификаций процессов регулируется структуры за счёт белков посттрансляционных первичной (фосфорилирования, протеолитического отщепления части белковой цепи и т.п.). Для изучения механизмов таких процессов необходимы нозволяющие контролировать активность исследуемых методы, на белков посттрансляционном этапе. Были разработаны системы, использующие контролируемый белковый сплайсинг для быс

1.7.5. Перспективы применения интеинов для очистки рекомбинантных белков и пептидов в промышленных масштабах. Промышленная ферментация предполагает рост клеток-продуцентов на синтетических средах, при высоких плотностях культур в течение продолжительного периода (до 40 часов). Такие условия способствуют повышению уровня экспрессии генов теплового шока и протеаз и могут вызвать деградацию рекомбинантного белка in vivo [101]. В работе [102] были смоделированы условия промышленной ферментац

Глава 2. Применение интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов.

2.1

Введение. В настоящее время на фармацевтическом рынке широко представлены препараты на основе полипептидов, состоящих из 30 и более аминокислот. Практически все эти препараты получают методами полного химического синтеза, что обуславливает их высокую себестоимость. Перспективным представляется препаратов на биотехнологический основе полипептидов. путь получения медицинских избежать в Как правил

2.2 Использование интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов с N-копцевым серипом па примере тимозина-ai.

2.2.1 Применение векторных систем на основе интенна See VMA. Искусственный ген тимозина-ai синтезировали химико- ферментативным способом из перекрывающихся олигонуклеотидов TY-1 TY-9 с последующей амплификацией при помощи ПЦР с праймерами PrTYl, TY-9. тимозин-ai Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-LysTCC-GAT-GCT-GCG-GTG-GAC-ACA-TCC-TCT-GAA-ATT-ACA-ACG-AAA- Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH GAT-CTG-AAA-GAA-AAG-AAA-GAA-GTT-GTG-GAA-GAG-GCT-GAG-

2.3.2 Оптимизация третьего способа получения глюкагоиа.

2.3.

2.1 Получение очищенных телец включения. Биомасса продуцента глюкагона Е. соИ ER2566/pERGl была получена на участке экспериментальной ферментации отдела биологического производства (ОБП) ИБХ РАН. Использование более богатой среды, чем при лабораторной ферментации, а также эффективная аэрация способствовали увеличению съёма биомассы до 10 граммов влажных клеток на литр культуры (по сравнению с 3 г/л культуры при выращива

2.3.3 Применение мини-интеина Ssp DnaB для нолучения рекомбинантого оксинтомодулнна Искусственный ген оксинтомодулина синтезировали химико- ферментативным способом из перекрывающихся олигонуклеотидов Glu-1 - Glu-6 и Oxm-1 - Oxm-4 с последующей амплификацией при помощи ПЦР спраймерами PrGlu-int и PrOxm-ter. His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-AspCAT-TCT-CAG-GGC-ACG-TTT-ACC-AGC-GAT-TAT-AGC-AAA-TAC-CTG-GACSer-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-LysTCT-