Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Роль метил-ДНК-связывающего белка каизо в контроле транскрипции генов позвоночных, регулируемых метилированием ДНК : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71725

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

2.1 Общая характеристика метилироваиия ДНК Метилирование остатков цитозина по пятому положению довольно широко распространено у животных. Эта ковалентная модификация азотистого основания ассоциирована с неактивной структурой хроматина и негативной регуляцией экспрессии генов [Bird, 2002]. Она была найдена как у многих беспозвоночных (например, у Drosophila melanogaster [Hung et al., 1999; Roder et al., 2000]), так и у оболочников {Ciona intestinalis [Simmen et al., 1999]), a также в более выс

Небольшая часть ЦфГ-островков в норме всё же подвергается метилированию - это ЦфГ-островки, связанные с импринтными генами и генами на неактивной Х-хромосоме [Ке, Collins, 2003]. Промоторы, ассоциированные с подобными последовательностями, остаются «молчащими» на протяжении всей жизни организма. Однако, если метилирование ЦфГостровков Х-связанных генов происходит во время эмбрионального развития [Takagi, 2003], то статус метилирования импринтных генов остаётся неизменным с момента созреван

Основные процессы, связанные с изменением статуса метилирования в геноме, заканчиваются к моменту имплантации эмбриона. Последующие эпигенетические перестройки, связанные с органогенезом и созреванием плода, а также нормальной жизнедеятельностью организма, выражены намного слабее. Однако картина резко меняется при опухолеобразовании. Эпигенетические изменения во время онкогенеза происходят, как правило, в следующих направлениях: общее деметилирование [Feinberg et al., 1988], гиперметилировани

Исследования белковых факторов, обладающих способностью к взаимодействию с метилированной ДНК, началось в конце 80-х годов, когда в лаборатории Э. Бёрда был охарактеризован метил-ДНК-связывающий комплекс, названный МеСР (далее - MeCPl - от niethyl-CpG-binding protein

1) [Meehan et al., 1989]. Было показано, что он играет важную роль в регуляции экспрессии репортёрных генов в том случае, если их промоторные области были метилированы. Для данного комплекса были описаны два, варианта, р

Несмотря на важность на данный невелико. метилирования момент Это ДНК, количество метил-ДНКчто, хотя охарактеризованных связывающихся генов-мишеней тем, белков обусловленно большинство нокаутов по генам метил-ДНК-связывающих белков имеет выраженный фенотип, поиск конкретных генов, уровень транскрипции которых оказался бы повышенным или пониженным в нокаутных животных, достаточно сложен. Тем не менее, найден ряд генов, экспрессия которых зависит от метилДНК-связывающих белков. В первую оч

В последние годы всё более активными становятся исследования, связанные с изучением так называемого «гистонового кода» - определённых модификаций структурных белков хроматина, специфически связанных с изменением или поддержанием статуса экспрессии генов. К настоящему времени уже известно большое количество модификаций гистонов: метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинирование и т.д. [Не, Lehming, 2003]. Наиболее хорошо изучены на данный момент ацетилирование и метилировани

Для получения белковых ядерных экстрактов и проведения иммунопреципитации хроматина использовали следующие культуры клеток: нормальными мышиными фибробластами NIH3T3, линией аденокарциномы мыщи с низким метастатическим потенциалом КСМЛ-0, линией карциномы прямой кишки НСТ116. Клеточные культуры поддерживали в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium; Invitrogen) с добавлением бычьей фетальной сыворотки (Hyclone) до 10% в присутствии пенициллина и стрептомицина (50 мкг/мл финальная концен

3.2 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комнлексов в геле Проводили мечение ДНК-зондов радиоактивным изотопом фосфора (

Р) в 5'-положении. Условия мечения: 2-3 пМоль ДЬЖ-зонда, 10 ед.

- Т4полинуклеотидкиназы (Fermentas; ЕК0031), 1х буфер «PNK buffer А forward buffeD) (50 мМ Трис-НС1 рН

7.6, 10 MMMgCb, 5 мМ DTT, ОЛмМспермидин и

0.1 мМ ЭДТА), 20 - 30 ^iCi ^^? (а-^¥ дезокси-АТФ); инкубировали 1 час при +37°С. Меченны

3.3 Метилирование ДНК-зондов для экснеримеитов но торможению ДНК-белковых комилексов в геле Метилирование ДНК-зондов проводили в следующих условиях: 5- 10 пМоль ДНК-зонда, 1х NE буфер 2 (50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-НС1 рН

7.9, 10 мМ MgCb, 1 мМ DTT), 10 ед. Sss I метилазы (New England Biolabs, Cat.№ MO226L),

3.7 мМ S-аденозилметионин; инкубировали 1 час при +37°С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 5 мМ с последующей инкубацией при +65°С в течение 10 мин. Метилированный ДНК-зон

Для включения в тело ДНК-зонда радиоактивного изотопа фосфора (•'^Р) использовали набор реактивов DecaLabeF'^ DNA Labeling Kit (Fermentas, Cat.№ K0622). Реакционную смесь, из 200-500 пг НЦР-продукта и 1х буфера, содержащего случайные декануклеотиды (

0.05 М Трис-НС1 рН

8.0, 5 мМ MgCb, 1 мМ DTT) инкубировали при +95°С в течение 5 мин для денатурации ДНК. Затем смесь охлаждали во льду и добавляли смесь дНТФ без аденина до концентрации

1.5 мМ, 30-50 ^iCi ^^Р (у-''^Р дезокси-АТФ

Клет1си культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бьиьей сыворотки, а также антибиотиков пенициллина и стрептомицина. При достижении 80% плотности культуры на чашке Петри диаметром 15 см клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ рН

7.4:

1.7 мМ КН2РО4,

5.2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl), отделяли с поверхности чашки, осаждали центрифугированием при 1 200 g и повторно промывали ФСБ. Все дальнейшие операции производили при температуре +4°С. Клетки с 10 чашек

3.6 Получение рекомбинаитно-экспрессированных белков Векторные плазмиды pGEX-2T (Amersham Biosciences), содержаи];ие в качестве вставок конструкции Каизо-GST или Каизо-ZF-GST, трансформировали в экспрессионный штамм Е.соИ BL21. Отдельные клоны отбирали и растили в жидкой среде LB в течение ночи при +37°С. Ночную культуру разбавляли в соотношении 1:100 и доращивали до концентрации А(600) = 1, после чего индуцировали экспрессию добавлением изопропил-тиоР-галактозида (ИПТГ) до конечной концентр

Образец ткани гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса в лизирующем буфере (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-НС1 рН

8.0, 25 мМ ЭДТА,

0.5% SDS,

0.1 мг/мл протеиназы

К) из расчёта 1 мл на 100 мг ткани и инкубировали 12-18 часов при температуре +37°С. Очистку ДНК проводили смесью фенол/хлороформ (1:1): добавляли 1 объём смеси «фенол/хлороформ», тщательно перемешивали, центрифугировали 3-5 мин в настольной центрифуге при 13000 g. Затем отбирали водную фазу и добавляли к ней

Образец ткани гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса в TRIzol Reagent (Invitrogen, 15596-026) из расчёта 1 мл на 100 мг ткани. Инкубировали 5 мин при комнатной температуре и добаляли

0.2 мл хлороформа на 1 мл TRIzol Reagent. Тщательно перемешивали и дополнительно инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем образцы центрифугировали в настольной центрифуге при 12000 g в течение 15 мин. Водную фазу переносили в новую микропробирку; туда же добавляли изопропилов

3.9 Полимеразная цепная реакция Специфическую амплификацию фрагментов ДНК производили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакция проводилась при следующих условиях: 5-10 нг ДНК, 1х буфер для Taq-полимеразы (10 мМ Трис-НС1 рН

8.8, 50 мМ КС1,

0.08% Nonidet Р40) 1 ед. Taq-полимеразы (Helicon, Н-1902-lkU),

1.5 мМ дНТФ, 10 пМоль каждого специфического примера; денатурация ДНК - 5 мин при 95С, далее - 28-35 циклов с 30 сек денатурации при 95 °С, 30 сек при температуре отж

3.10 Клонирование ПЦР-продукта в p-GEM-T вектор Свежесинтезированный ПЦР-продукт очищали в агарозном геле или из ресктрикционной смеси с помощью набора реактивов для очистки ПЦРпродукта QAIquick PCR-purification kit или для элюции ДНК из геля QAIquick Gel-extraction kit (Cat.№ 28706) согласно протоколам фирмы-производителя. Полученный фрагмент лигировали в p-GEM-T вектор (Promega, Cat.№ A3600). Условия лигирования: 1х буфер для лигирования, 50 нг ветора pGEM-T, 3 ед. Т4 ДНК-лигазы; инкубирова

Для проверки статуса метилирования ДНК-зондов или полученных при иммунопреципитации хроматина фрагментов ДНК использовали так называемый Hpa/Msp-тест: фрагмент ДНК обрабатывали чувствительной к метилированию ДНК эндонуклеазой рестрикции Hpall (Fermentas, Cat.№ER0511) или нечувствительной к метилированию ДНК эндонуклеазой рестрикции Mspl (Fermentas, Cat.№ ER0541) в течение 1 часа при +37°С в 1х буфере Yellow/Tango (Cat.№ BY5). Для анализа рестрикционного полиморфизма в области D3 HI9 DMR исп

3.12 Трансформация E.coli и выделение нлазмидной ДНК Клонированный в pGEM-T вектореую плазмиду ПЦР-продукт или экспрессирующий вектор смешивали с компетентными клетками Е.соИ и инкубировали на льду в течение 15 мин. Затем клетки подвергали тепловому шоку при +42'^С в течение 1 мин, после чего дополнительно инкубировали на льду также в течение 1 мин. Далее к трансформированным клеткам прибавляли 800 мкл среды LB, инкубировали при +37°С в течение 1 часа и высаживали на LB-arap с соответствуюш,