Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Характеристика нового семейства сайт-специфических эндонуклеаз, кодируемых Т5-подобными бактериофагами : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71722

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

2) Картирование точек разрывов, вносимых в ДНК, эндонуклеазами ¥-Т/11, F-T/lll, ¥-Щ11 и ¥-ЩЧ. 3) Разработка схемы очистки и выделения эндонуклеаз F-T/JI и F-7y7II.

4) Биохимическая характеристика эндонуклеаз F-T/R и F-7/711.

5) Картирование сайта узнавания эндонуклеазы F-Tflll. Научная новизна. В результате данной работы были впервые охарактеризованы четыре гомологичные сайт-специфические H-N-H-эндонуклеазы, гены которых расположены вне интронов. Впервые проведено картирование с

1.1. Хоуминг-эндонуклеазы. В составе интронов типа I и типа II обычно присутствуют ОРС, кодирующие сайтспецифические эндонуклеазы, инициирующие процесс переноса интрона с фланкирующими его участками ДНК в лишенный данного интрона аллель гена (Belfort and Roberts, 1997; Jurica and Stoddard, 1999; Gimble, 2000; Edgell et al., 2000; Chevalier and Stoddard, 2001; Guhan and Muniyappa, 2003; Stoddard, 2005). Этот процесс получил название хоуминг (от английского слова "homing" возвращен

1.3. Каталитический центр H-N-H-эндoнyклeaЗt

. Первая информация о структурной организации каталитического центра H-N-Hэндонуклеаз была получена в 1999 году, когда двумя независимыми грунпами исследователей были опубликованы данные по кристаллической структуре нуклеазных доменов неспецифических нуклеаз колицинов Е7 и Е9 в комплексе с соответствующими иммунными белками 1т7 и 1т9 (Kleanthous et al., 1999; Ко et al., 1999). Доказательства того, что аминокислотные остатки H-N-H-мотива участвуют в связывании ДНК-субстрата и катализе были п

. Как уже бьшо сказано выше, активный центр H-N-H-эндонуклеаз координирует один ион металла, причем представители этого семейства отличаются друг от друга в своих пристрастиях по отношению к связываемым ионам. Так, колицины Е9 и Е7 связывают ион Zn^^ приблизительно на три порядка более прочно, чем ионы Ni^"^ и Со^^ тогда как эндонуклеаза l-Hmul предпочитает связывать ион Мп^^ (Pommer et al., 1999; Keeble et al., 2002; Ku et al., 2002; Shen et al., 2004). Какова же роль иона металла в с

1.3.3. Единство структурной и функциональной организации каталитического центра нуклеаз суперсемейства "рра-Ме ". В результате анализа структур каталитических центров специфической нуклеазы \-Ppol (семейство "His-Cys box") и таких неспецифических нуклеаз, как нуклеаза из Serratia marcescens и колицип Е9 (семейство "H-N-H") было ноказано, что эти нуклеазы, несмотря на отсутствие гомологии аминокислотных последовательностей, обладают общей укладкой каталитическог

1.2.4. Модель катализа гидролиза ДНК эндонуклеазами семейства "H-N-H". На основании сходства структур каталитических центров колицинов Е7, Е9, нуклеаз 1-Рро1 и Serratia Поммером и др. было предложено два механизмагадролизаДНК H-N-H-эндонуклеазами, один из которых предполагал участие ионов Mg ^, другой - ионов Ni^^ (Pommer et al., 2001). Однако разрешение структуры Н103А Е9 ДНКаза/дцДНК/Mg^^ показало, что ионы Mg^* координируются теми же аминокислотными остатками активного центра,

. Роль H-N-H-эндонуклеаз, вносящих двуцепочечные разрывы в ДНК, в клеточных процессах мало изучена. Так, известно, что при скрещивании Chlamydomonas moewusii и С. eugametos наблюдается конверсия нуклеотидпой последовательности С. moewusii, содержащей 2 интрона psbA, при этом, по крайпей мере, 1 из этих интронов кодирует активную H-N-H-HyKiiea3y l-Cmoel (Drouin et al., 2000). Таким образом, можно предполагать, что эндонуклеаза l-Cmoel инициирует хоуминг кодирующего ее интрона psbA. Относител

1.5. Узнавание ДНК-субстратов хоумннг-эндонуклеазами.

. Эндонуклеазы рестрикции и хоуминг-эндонуклеазы - это сайт-специфические нуклеазы, которые узнают и разрезают онределенные последовательности ДНК (Chevalier and Stoddard, 2001; Pingoud and Jeltsch, 2001). Одним из основных факторов, определяющих специфичность узнавания этих последовательностей ДНК, является количество водородных связей, которые образуются между основаниями ДНК и аминокислотными остатками фермента напрямую или через молекулы воды (Chevalier et al., 2003). Более того, специф

1.5.2. Взаимодействие эндонуклеазы I-Crel с сайтом узнавания. Один из наиболее изученных эндонуклеаз эндонуклеаза представителей \-Сге\ в LAGLIDADG-семейства виде гомодимера хоумингс связывается псевдопалиндромной последовательностью ДНК из 22 н.п. (рис. 5; Jurica et al., 1998). Аминокислотные остатки фермента, входящие в состав цепей р1 и р2 образуют большую часть прямых водородных связей с парами оснований 3-11 ДНК-субстрата (рис. 56; Jurica et al., 1998; Chevalier et al., 2003). О

1.5.3. Взаимодействие эндонуклеазы I-Ppol с сайтом узнавания. Эндонуклеаза \-Рро\ - единственный представитель семейства "His-Cys box" хоуминг-нуклеаз с известной структурой комплекса фермент-ДНК (рис. 6а). Сайт узнавания этой нуклеазы представлен псевдопалиндромной последовательностью ДНК из 14 н.п. (Chevalier and Stoddard, 2001). Эндонуклеаза l-Ppol, также как и \-Сге\, в виде гомодимера связывается с сайтом узнавания с помощью р-слоя из трех антипараллельных Р-цепей (Р3-Р4-Р5),

1.5.4. Взаимодействие эндонуклеазы I-TevI с сайтом узнавания. Эндонуклеаза I-7evI, относящаяся к семейству хоуминг-нуклеаз "GIY-YIG", имеет двухдоменную структуру с N-концевым каталитическим и С-концевым узнающим доменами, соединенными между собой подвижным линкером (рис. 1а; Derbyshire et al., 1997). Несмотря на относительно небольшой размер (28 кДа), эта нуклеаза в виде мономера связывается с протяженной асимметричной последовательностью ДНК из 35-37 н.н. (Mueller et al., 1995;

. Экспрессию генов hegC и hegD проводили в щтамме Е. соИ МС1061 (Maniatis et al., 1989). При получении плазмид pGFIBl/Ser2 и pUC19/orfl7-Gly в качестве щтаммахозяина использовали Е. coli Z85 (Zaitsev et al., 1986). Бактериофаг Т5 Е. coli был любезно предоставлен В.И. Тапящиным (ИБФМ им. F.K. Скрябина РАН), Т5-подобные бактериофаги BF23 Е. coli и фаг 5 (ф5) Salmonella enterica cv. Heidelberg (Demczuk et al., 2004) - соответственно К. Хеллером (К. Heller, Federal Dairy Research Centre, Kiel,

. Полимеразную ценную реакцию (ПЦР), секвенирование ДНК с иснользованием НЦР-фрагментов, разделение белков SDS гель-электрофорезом, электрофорез ДНК в полиакриламидном (в неденатурирующих и денатурирующих условиях) и агарозном гелях, а также электрофоретическое разделение РНК в формальдегидном агарозном геле цроводили как онисано (Maniatis et al., 1989).

. В качестве ДНК-субстратов нри тестировании активности эндонуклеаз ¥-Т/П. и FTJRl в процессе их очистки иснользовали соответственно нлазмиды pGFIBl/Ser2 и pUC19/orfl7-Gly. В качестве ДНК-субстратов иснользовали также ПЦР-фрагменты. Названия этих фрагментов, а также матричная ДНК и нраймеры, иснользованные нри их синтезе указаны в таблице I, Таблица 1 Название субстрат 1а субстрат 1Ь субстрат 2а субстрат 2Ь субстрат За субстрат ЗЬ субстрат Зс субстрат 4 матричная ДНК ДНК фага BF23 ДНК фага

2.5. Получение матричной ДНК для транскрипции in vitro. Фрагменты ДНК, используемые в дальнейшем в качестве матрицы для транскрипции in vitro, получали с помощью трехпраймерной ПЦР. Для амплификации каждой из ОРС использовали универсальный праймер (5'obe-u2) и пару специфических праймеров, комплементарных соответственно матричной и кодирующей ценям ДНК: 5'04-cfl и G2-3' (в случае гена hegk), 5'-ph4-cfl и BF-P QiegQ), 5'015-cfl и Serlr {heg(Z), 5'018-cfl и 3'Gly QiegD). Структура праймеро

2.6. Транскрипция in vitro. Реакцию транскринции ш vitro проводили в 100 мкл смеси, как было описано в (Gurevich et al., 1991; Pokrovskaya and Gurevich, 1994). Реакционная смесь содержала 200 мМ HEPES-KOH (рН 7,6), 30 мМ MgCb, 40 мМ дитиотрейтол, 7 мМ каждого НТФ ("Roche", Германия), 2 мМ спермидин, 10 мкг бычьего сывороточного альбумина, 25 единиц ингибитора РНаз "RNAguard" ("Amersham/Pharmacia Biotech", США), 4-5 мкг ДНК-матрицы и 500 единиц Т7 РНК-полимеразы

2.7. Синтез белка в бееклеточпой еистеме трансляции из зародышей пшеницы. Синтезированные in vitro транскринты транслировали в бесклеточной системе биосинтеза белка из зародышей пшеницы как было онисано ранее (Shaloiko et al., 2004). Реакцию трансляции нроводили в 25 мкл смеси, содержащей 40 мМ HEPES (рН 7,6), 3,5 мМ Mg(0Ac)2, 80 мМ КОАс, 6 мМ дититрейтол, 1 мМ АТФ, 0,1 мМ ГТФ, 0,25 мМ снермидин, 8 мМ креатинфосфат, 60 мкг/мл креатинфосфокиназа (350 ед./мг), 50 мкМ ['''С] лейцин (320 мКи/мм

. Во всех экспериментах, если условия особо не оговариваются, гидролиз ДНК эндонуклеазами проводили в течение 20 мин при температуре 37''С в стандартном растворе (15 мкл) следующего состава: 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCh. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ. Нри нервичной характеристике, а также при картировании точек разрывов, вносимых эндонуклеазами F-Tfll, F-TflU, F-Tfllll и F-7y7IV ^^Р-меченый ДНК-субстрат инкубировали с соответствующ

2.10. Экспрессия и очистка эндонуклеаз F-TJll и F-Tflll. Клетки Е. соИ штамма МС1061, содержащие плазмиду pBADexl-F-7y7I, выращивали в 10 л питательной среды МКА (М9 с добавлением казаминовых кислот до 0,2% и ампициллина до 100 мкг/мл) при 37°С в условиях аэрации до OD6oo=0,6. При выращивании клеток Е. соИ МС1061, содержащих плазмиду pBADex2-F-7/711, нами была отмечена необычайно высокая нестабильность этой плазмиды при многочисленных пассажах клеток с одной среды на другую. В связи с

2.11. Картирование сайта узиавания эндонуклеазы F-7/7II.

. При образовании комплекса меченый но 5'-концу одной из цепей фрагмент ДНК "субстрат 7" (3 нмоль) инкубировали с эндонуклеазой F-7y7II (14 пмоль) или с БСА (2 мкг) в качестве контроля, ДНК-субстрат или его комплекс с эндонуклеазой Y-Tfl{\ обрабатывали модифицирующими агентами в таких условиях, при которых молекула ДНК модифицируется в среднем только в одном ноложении.

1.1. Защита от ДНКазы I. Образование комплекса проводили при 25°С в течение 15 мин в реакционной смеси (15 мкл) следующего состава: 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 100 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСЬ, 5 мМ MgCb и 0,6 мкг ДНК из тимуса теленка. Гидролиз ДНКазой I (10"^ единиц; "Boehringer", Германия) проводили при 25°С в течение 2 мин. Реакцию останавливали добавлением 85 мкл раствора, содержащего 200 мМ NaCl, 20 мМ ЭДТА, 1% SDS.

1.2. Защита от гидроксилъных радикалов. Образование комплекса проводили в реакционной смеси (15 мкл) следующего состава: 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 100 мМ NaCl и20 мМ ЭДТА. Защиту от гидроксильных радикалов проводили как описано (Tullius and Dombroski, 1986; Dixon et al., 1991), Раствор Ре(11)-ЭДТА готовили непосредственно перед реакцией смешиванием равных объемов 2 мМ (NH4)2FeSO4*6H2O ("Sigma", США) и 4 мМ ЭДТА. Приготовленный раствор (2,1 мкл), а также 0,03% Н2О2 ("Fluka"

1.3. Защита от диметилсулъфата. Образование комплекса проводили при 30°С в течепие 10 мин в реакционной смеси (15 мкл), содержащей ДМС-буфер (50 мМ какодилат натрия (рН 8,0), 10 мМ MgCl2, 1мМ ЭДТА) и 1 мкг ДНК из тимуса теленка. Защиту от метилирования проводили как бьшо описано в (Махат and Gilbert, 1977; Siebenlist and Gilbert, 1980; Hendrickson and Schleif, 1985). Реакционную смесь разводили до 200 мкл ДМС-буфером и охлаждали до 0°С. Метилирование ДНК инициировали добавлением 5 мкл димет

. В этих экспериментах в качестве ДНК-субстратов нри образовании комплексов использовали модифицированные фрагменты ДНК. Метилированные ДНК-субстраты и субстраты с удаленным и нуклеозидом получали радикалами обработкой как было соответственно описано выше. диметилсульфатом гидроксильными Этилированные фрагменты ДНК нолучали как описано в (Махат and Gilbert, 1977; Siebenlist and Gilbert, 1980; Hendrickson and Schleif, 1985). Меченый no 5'-концу одной из цепей фрагмент ДНК растворяли в 10

. Секвенирование ДНК-субстрата по Максаму-Гилберту (A+G) проводили как описано (Maniatis et al., 1989). При модификации остатков нуриновых оснований к реакционной смеси (18 мкл), содержащей ^^Р-меченый по одной из цепей ПЦР-фрагмент и ДНК из тимуса теленка (1 мкг), добавляли 2 мкл формиата пиримидина ("Sigma", Германия). Смесь инкубировали при 37°С 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 240 мкл раствора, содержащего гидразин ("Sigma", Германия). Модифицированный фрагм

. Продукты гидролиза напрямую или после предварительной экстракции фенолом в случае экспериментов по защите осаждали этанолом в присутствии 0,3 М КОАс, 20 мкг гликогена и дважды повторно осаждали из 0,3 М NaOAc (рН 5,0). Полученные образцы растворяли в буфере для нанесения и наряду с продуктами секвенирования ДНКсубстратов по Максаму-Гилберту (A+G) разделяли электрофорезом в 8% ПААГ, содержащем 8 М мочевину.

. Высущенные гели визуализировали с использованием системы "Cyclone Storage Phosphor System" ("Packard Instruments Co.", США). Денситометрическое сканирование радиоавтографов проводили с использованием программы, написанной специально для обработки результатов картирования М.Б. Амзараковым. В экспериментах по защите сравнивали интенсивности поглощения полос образцов, содержащих свободный ДНКсубстрат и его комплекс с эндонуклеазой F-7/711. В качестве значения интенсивност

2.12. Компьютерный аналнз аминокислотных носледовательностей. Поиск последовательностей, гомологичных изучаемым белкам, и их выравнивание проводили на веб-сайте "NCBI" (ЬКр://уууу\у.псЫ.п1т.п!Ь.ооу/Ыа50 с использованием "PSIBLAST" (Altschul et al, 1997). Поиск белковых доменов и мотивов проводили в базе данных "InterPro" (Mulder et al., 2005). Вторичная структура эндонуклеаз F-7y7I, F-7/711, F7/7111 и F-7/7IV была предсказана с использованием программы "Ps