Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71714

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

3.3.4. Применение полученных fbr-мутантов CPSase в нроцессе конструирования штамма-нродуцента аргинина ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 87 90 91 список ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ а.о.

- аминокислотный остаток ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ДТТ - дитиотреитол н.

- нуклеотид НГ - нитрозогуанидин ПААГ - нолиакриламидный гель п.н.

- пара нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция т.п.н.

- тысяча пар нуклеотидов т е х - тонкослойная хроматография ЭДТА - этиленд

1.1 .Искусственная эволюция белков. Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в нрироде, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты. Однако физические и химические свойства таких природных белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промыщленного применения, что вызывает необходимость в разработке технологий, позволяющих получать белки с другими, чем у исходных, свойствами. Наприме

. Решение задачи направленного получения мутаций стало реальным лишь после появления методов клонирования фрагментов ДНК, позволивших модифицировать иптерссующие исследователя гены in vitro, пе затрагивая при этом всего остального генома. Систематические исследования в этой области официально документированы с 70-х годов прошлого века (Campbell et al, 1973; Hall, 1973; Hall and Hartl, 1974; Ларионов и Никифоров, 1982). Самый первый пример подобной работы - эволюция белка ErgA в Escherichia с

Различные методы создания библиотек ДНК. второй категории относятся методы направленного мутагенеза, при которых мутации вносятся в определенный, заранее заданный участок гена (сайт- специфичный мутагенез, мутагенез рандомизированными олигонуклеотидами). Третья категория объединяет в себе все методы, связанные с рекомбинацией ДНК (различные виды перетасовки ДНК, негомологичная рекомбинация).

1.1.2. Искусственная эволюция белков методами мутагенеза.

. Мутагенез как природный и искусственно индуцируемый процесс известен давно. Еще в 1946 году Нобелевская премия была присуждепа Г.Дж. Меллеру за открытие радиационного мутагенеза. В этот же год в журнале "Доклады Академии наук" выходит приоритетная статья по этому направлению "Карбонильные соединения и химический механизм мутаций" Н.А. Рапопорта (Рапопорт, 1946). Возглавляя отдел химического мутагепеза Нпститута химфизики, И. А. Рапопорт стал основателем нового научно-пра

2.2. Метод подверженной ошибкам ПЦР Метод подверженной ошибкам ПЦР (error-prone PCR) основан на нроведении амнлификации целевого фрагмента с номощью нолимеразной ценной реакции, нри которой искусственно новышается вероятность встройки ошибочного, то есть некомнлементарного нуклеотида. Одна из наиболее часто используемых методик проведения подверженной ошибкам ПЦР заключается в частичной замене ионов Mg^'*' меньшим количеством ионов Мп^"^, в условиях несбалансированных количеств разл

3. Искусственная эволюция мутагенеза.

. В 1993 г. была вручена Нобелевская премия К.Мюллису и М.Смиту за разработку мутагенеза метода (site-directed сайт-специфического mutagenesis). (олигонуклеотид-паправленного) появлепию этого метода белков методами направленного Благодаря произошел кардинальный пересмотр стратегий мутагепеза, поскольку ранее исследователям приходилось тратить много времени на поиск среди мутагенизированных химическими агентами рекомбинантных клонов тех, что содержали именно нужный вариант. Принцип сайт-спе

. Сайт-сосредоточенный мутагенез (site-saturation mutagenesis) - это метод мутагенеза, являющийся логическим продолжением сайт-специфического мутагенеза. Метод введения мутаций внолне аналогичен предыдущему, за исключением того, что синтезированный олигонуклеотид является частично вырожденным. Это позволяет вводить в последовательность белка не конкретную аминокислотную замену, а нолучать целый спектр мутантных белков, имеющих в интересующем исследователя ноложении любой из возможных аминоки

. Метод мутагенеза рандомизированными олигонуклеотидами (random методов oligonucleotide mutagenesis) - один из самых распространенных искусственного ускорения эволюции белков {Sneeden and Loeb, 2003). Это метод используется для получения большого количества разнообразных мутантов, различающихся по нескольким аминокислотным остаткам в специфическом участке гена. Мутации в этом случае кодируются рандомизированным синтетическим олигонуклеотидом. Количество мутаций в индивидуальном белке онред

1.1.4. Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза.

. Метод перетасовки ДЬЖ, или Д С шаффлинг (DNA Shuffling) - это метод ИК искусственной эволюции белков in vitro, специально разработанный для получения их измененных форм нутем комбинирования фрагментов генов двух или большего числа гомологичных белков (рис.

1.2). Метод получил название от одного из значений английского слова shuffle - «тасовать» и был предложен американцем В.Стеммером в 1994 г. На первом этапе используется двухраундовая ПЦР- амплификация, идуш;ая без участия праймеров

. Штаммы-продуценты различных микроорганизмов, используемые в к промышленности, как правило, являются чрезвычайно чувствительными температуре, рН среды и ее минеральному составу, причем небольшое изменение этих параметров может вызвать суш;ественное снижение уровня продукции. В большинстве случаев устойчивость данного микроорганизма к изменениям внешних условий не может быть достигнута заменой одного гена. Следовательно, возникает необходимость проведения искусственной эволюции не отдельног

Метод прерывистой элонгации (Staggered Extension Process, StEP), также как и метод перетасовки ДНК, предполагает наличие циклов плавления, отжига и 27 достройки для нолучения нолноразмерного гена (рис.

1.2) {Zhao et al, 1998; Aguinaldo and Arnold, 2003). Этот метод не предполагает расщепление или частичную деградацию ДНК, вместо этого используют очень короткий промежуток времени для элонгации, при котором удлинение комнлементарной цепи нроисходит только на несколько нуклеотидов. В резу

Метод случайного образования химерных молекул на временной матрице (RAndom CHImeragenesis on Transient Templates, RACHITT, рис.

1.2) был предложен в 2001 году {Coco et al, 2001). Он основан на отжиге мелких фрагментов ДНК родительских генов как праймеров на одноцепочечной полноразмерной матрице, нредставляющей собой полиурацил. При этом образуются шнильки из олигонуклеотидов как линкеры между участками, имеющими низкую гомологию, что позволяет увеличить частоту рекомбинации 28 между п

. Метод, позволяющий провести рекомбинацию длинных генов или целых оперонов, предложен Волковым и соавторами и основан на образовании гетеродуплекса из родительских плазмид (Heteroduplex) (Volkov et al, 1999). Добиться in vitro рекомбинации больщих кусков ДНК, таких как опероны или искусственные хромосомы, довольно сложно с методологической точки зрения. В данном методе происходит формирование гетеродуплекса in vitro, который далее используется для трансформации бактериальных клеток. Клетка-х

. Техника сборки соответствующих олигонуклеотидов (Assemly of Designed Oligonucleotides, ADO) впервые описана в 2003 году для рекомбинации генов (Zha et al., 2003). ADO основывается на использовании последовательности нуклеотидов в неконсервативной области гена для синтеза соответствующего пула синтетических вырожденных олигонуклеотидов. Фланкирующая область каждого синтетического фрагмента содержит последовательности консервативных областей, которые используются в качестве линкеров при г

. Сонг и соавторы (Song et al, 2002) разработали метод мутагенной и однонаправленной повторной сборки (Mutagenic and Unidirectional ReAssembly, MURA) для создания библиотек ДПК случайно усеченных белков. В этом методе последовательность ДПК полученная методом перетасовки с постепенно кодонах увеличивающимся усечением может быть совместно представлена с родительским геном в одном эксперименте. Методика MURA состоит из четырех этапов. Первоначально получают случайные фрагменты родительского

. Метод экзонной перетасовки (Ехоп Shuffling) является эволюционным механизмом, в ходе которого, с помощью рекомбинации негомологичных генов in vitro, создаются новые объекты, известные как мозаичные белки (Kolkman and Stemmer, 2001). Был описан процесс природной {in vivo) экзонной перетасовки для ряда семейств генов, на основе анализа их структуры и доменной организации {Dupuy et ah, 2002). Аналогично нроцессу природной экзонной перетасовки, экзонная перетасовка in vitro может быть проведен

. В то время как варианты белков, полученных с помощью гомологичной рекомбинации или случайных точечных мутаций, являются более предпочтительными для сохранения структурной схожести с родительскими белками, негомологичная рекомбинация (Nonhomologous Recombination) ведет к эффективному созданию новых белковых структур. На данный момент онисано много методов негомологичной рекомбинации. Наиболее широко известны такие методики, как постепенное усечение нри создании гибридного белка (Incremental

.

. Одним из свойств живых организмов является сохранение постоянного баланса между необходимыми для поддержания жизнедеятельности различными катаболическими (биодеградативными) процессами и огромным количеством анаболических (биосинтетических) процессов. Клеточный гомеостаз обеспечивается регуляторными механизмами различной природы, среди которых важная роль припадлежит механизму регуляции активности ферментов, занимающих ключевые позиции в метаболических путях, определенными метаболитами

. Ретроингибирование, частный случай аллостерической регуляции, - один из важнейших механизмов регуляции биохимических процессов в клетке. Оно основано на ингибировании фермента конечным нродуктом реакцнн или цепочки реакций и контролирует уровень синтеза данного продукта в клетке. Поэтому является целесообразным для использования в штаммах-нродуцентах конструирование таких мутантных белков, аллостерическая регуляция которых конечными продуктами реакций была бы нарушена (fbr, feed back resis

К сожалению, нро свойства NAGS известно довольно мало. Nкарбамоилфосфат ацетилглутамат синтетаза (NAGS) E.coli (Е

2.3.

1.1) - фермент, кодируемый геном argA, осуществляет нервую реакцию пути биосинтеза аргинина, ацетилирование глутамата: L-глутамат + ацетил-СоА +^ N-aцeтил-L-глyтaмaт + СоА Белок молекулярный присутствует вес одной в клетке в нескольких составляет олигомерных формах, субьединицы 49,2 кДа. Реальный молекулярный вес олигомеров зависит от концентрации белк

N-ацетилглутамат киназа (NAGK, Е

2.7.

2.8) - это фермент второго шага пути биосинтеза аргинина, кодируемый геном argB. Фермент использует ADP для фосфорилированияИ-ацетилглутамата: К-ацетил-Ь-глутамат + АТР = N-ацетилглутамил-фосфат + ADP В отличие от Е.соИ, в организмах, имеющих циклический путь синтеза орнитина, этот фермент подвержен ретроингибированию, и именно он играет центральную регуляторную роль {Fernandez-Murga et al, 2004). Структура NAGK довольно хорошо изучена, сде

.

. Карбамоилфосфат синтетаза (CPSase, Е

6.3.

5.5) Е.соИ катализирует комплекс реакций синтеза карбамоилфосфата ключевым сразу для двух (уравнение 1). Этот фермент является аргинина (рис.

1.3.) и путей биосинтеза - пиримидиновых нуклеотидов (рис.

1.4.). Для активности ферменту абсолютно необходимо присутствие свободных ионов магния (Raushel et al., 1979; Thoden et al, 1999a). В случае, когда один или несколько субстратов отсутствуют, фермент может осуществлять три отде

Аллостерическая регуляция фермента осуществляется посредством связывание орнитина, IMP и UMP с соответствующими сайтами, расположенными в карбокситерминальной области большой субъедипицы белка, аминокислотные остатки которой образуют 5 параллельных р-слоев (Rubio et al., 1991; Cervera et al, 1996; Thoden etal, 1997 Thoden etal, 1999a). Thr977 Lys 993 Lys 954 HN Val994

3.0 A •-•(H20 ThrlOie 0 = 0 —

3.0 A^ f Ф Ф p » 0 Ф* t « ; aoA Astt 1015 Thr1017 Рисунок

1.6. А

5.3. Регуляция транскрипции оперона сагАВ Оба гена, кодирующие карбамоилфосфат синтетазу, принадлежат онерону сагАВ, транскрипция которого кумулятивно репрессируется конечными продуктами обоих путей биосинтеза {Charlier et al., 1992; Wang et al., 1998; Kholti et ah, 1998; Thoden et ai, 1997). Один промотор, P2, репрессируется регуляторным белком ArgR, другой, PI, подвержен регуляции IHF и регуляторным белком СагР, которые одновременно являются и активатором и репрессором транскринции этого о

Использованные и сконструированные в процессе работы бактериальные штаммы представлены в Таблице

2.1. Таблица

2.1. Использованные в работе штаммы E.coli. Штаммы К12 TG1 Е.соИ Генотип {supE, thi-1 (lac-proAB), (тсгВПроисхождение Коллекция ВКПМ hsdSM}5{xK.

- шК-), [F' traD36 proAB {Sambrooketal, 1989) /ac/qZM15]) Коллекция ВКПМ and (proBA, argD) {Eckhardt Leisinger, 1975) Коллекция ВКПМ к.б.н. Гусятинер М.М. ЗАО "АГРИ" Коллекция ВКПМ {argA:: TnlO), устойчив к 6Колле

2.1.1. Конструирование штамма B7::argA-m13::argGH Штамм B7::argA-ml3::argGn был получен с использованием mini-Mu интегративной системы, разработанной в нашем Институте под руководством проф. В.З. Ахвердяна. С целью введения в геном штамма В7 мутантного гена argA-ml3 была проведена Ми-зависимая интеграция фрагмента Pi-argA-ml3 в хромосому данного 49 штамма. В качестве интегративной рекомбинантной плазмиды брали созданную нами плазмиду pMIV-5-Pi-argA-ml3 (см. разд.

2.3.4.), несуш;ую инте

Среды Luria-Bertani (LB) и М9 приготовлены согласно (Maniatis et al, 1982). Селективный отбор клонов проводили на соответствующих агаризованных средах, содержащих ампициллин (100 мкг/мл), хлорамфеникол (25 мкг/мл) или канамицин (50 мкг/мл) при 37°С. Индукция экспрессии целевых генов, находящихся под контролем lac репрессора, осуществлялась путем добавления в культуральную среду IPTG до конечной концентрации 1 мМ с последующей инкубацией в течение 2 часов.

2.2.2. Условия культивирования

2.3. Эксперименты с рекомбинантной ДНК

Генно-инженерные манипуляции, электрофорез линейной и плазмидной ДНК, трансформацию бактерий плазмидной ДНК, НЦР-амплификацию проводили по стандартным методикам {Sambrook et ah, 1989) или согласно рекомендациям фирм-производителей соответствующего оборудования и реактивов (Pharmacia Biotech, Швеция; MBI Fermentas, Литва; BioRad, США). Нраймеры для ПЦР амплификации, использованные в данной работе (Таблица

2.2) были синтезированы в ЗАО "Синтол" (Москва). ПЦР-амплификацию проводи

2.3.2. Конструирование плазмиды pUC18-argl Фрагмент ДНК длиною 1,1 т.н.н., содержащий структурную и регуляторную части гена argI, был получен НЦР-амплификацией соответствующего участка хромосомы Е. соИ с использованием олигонуклеотидов argil и argI2 в качестве 53 праймеров. Амнлифицированный фрагмент был фланкирован сайтами рестрикции BgUl и Sail. Фрагмент был очищен с номощью электрофореза в агарозном геле, обработан рестриктазами BglU и SaK, и лигирован в вектор pUC WBamHl-Sall. Схема получ

2.3.3. Конструирование плазмиды pKK-argA-wt Для конструирования плазмиды pKK-argA-wt (рис.

2.2.) был амплифицирован ген дикого типа, содержащийся на плазмиде pUC19-ArgA. В качестве праймеров были использованы олигонуклеотиды argA-start, комплементарный последовательности гена argA, и обратный праймер М13. Фрагмент Д1Ж, длиной 1,78 т.п.н. и кодирующий полноразмерный ген argA, был очищен электрофорезом в агарозном геле и обработан эндонуклеазами Ncol (сайт которой включает в себя ATG

2.3.4. Конструирование плазмиды pMIV-5-PrargA-m13 Для конструирования плазмиды pMIV-5-Pi-argA-ml3 мутантный ген argAml3 был клонирован под контролем промотора гена argi и сайта связывания Ptrc Ncol (273) Sail (417) argA-start argA pKK-argA-wt 6361bp Hindlll C20.S7) 'BamHI/Bglll(1544) bla Рисунок

2.1. Структура рекомбинантной плазмиды р и с 18-argI Рисунок wt.

2.2. Структура рекомбинантной плазмиды pKK-argA- 54 рибисом (RBS) гена ф10 фага Т7 в интеграционный вектор pMIV-

2.3.5. Конструирование плазмиды pMIV-5-PrargGH Для конструирования плазмиды pMrV-5-Pi-argGH гены argG я argH были клонированы под контролем промотора гепа argl в интеграционный вектор pMIV5. Фрагмент ДНК, длиной 1,35 т.п.н. и кодирующий полноразмерпый ген argG с собственной SD-последовательностью был получеп ПЦР-амплификацией соответствующего участка хромосомы Е. соИ с использовапием олигонуклеотидов argG-start и argG-end в качестве праймеров. Амплифицированный фрагмент был фланкирован сайта

2.3.6. Конструирование плазмиды pET- Plac р-1ас2 Xbal Bglll (1) fXbai(139) Drain (713) A«ll(3742) Promoter Sad (4947) Xbal Drall Sad pBScarAB-13 Рисунок

2.3. Схема конструирования плазмиды pEL-carAB-wt. Плазмида pET22-b(+) была модифицирована с целью замены Т7-промотора на /ас-промотор. Последовательность /ас-промотора была получена ПЦР- амплификацией соответствующего фрагмента плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов р-1ас1 и р-1ас2 как праймеров (рис.

2.3).

2.3.7. Конструирование плазмиды pEL-carAB-wt Плазмида pET-Piac была использована для клонирования оперона сагАВ из плазмиды pBScarAB-13 без промоторной последовательности этого оперона. 5'- 56 Концевая последовательность гена сагА (1Д8 т.н.н.) была получена ПЦРамплификацией с иснользованием нлазмиды pBScarAB-13 и олигонуклеотидов caral и сага2 как праймеров (рис.

2.3). 5'-Концевой Xbal-Dralll фрагмент (0,61 т.п.н) сагА был очищен с помощью электрофореза в агарозном геле после гидролиза

2.3.8. Конструирование малокопийных плазмид, содержащих гены сагАВ Плазмиды pEL-carAB-wt и pEL-carAB-34 расщенляли рестриктазами Sad и Xbal (частичный гидролиз, так как плазмиды содержат два сайта Xbal), и фрагменты, кодирующие гены сагАВ, клонировали в вектор pMW119/5'acI -Xbal. В результате были получены малокопийные нлазмиды pMW-carAB-wt и pMWсагАВ-34, содержащие гены сагАВ - wt я мутантные гены сагАВ соответственно, под контролем /ас-промотора. 34,

2.4.1. Создание библиотеки мутантных агдА генов Для конструирования совокупности мутантных генов argA с различными заменами, на первом этапе был амплифицирован фрагмент гена, кодирующий носледовательность от 20-го аминокислотного остатка до конца фермента NAGS. В качестве матрицы была иснользована плазмида pUC19-ArgA, а в качестве нраймеров - argA-rand (PI) частично комплементарный последовательности гена argA, и Р2 - обратный праймер М13. Фиксированные 16 нуклеотидов на 3'-конце последовател

2.4.2. Создание библиотеки мутантных сагВ генов Для конструирования совокупности мутантньгх генов сагВ с различными заменами, на первом этапе был амплифицирован фрагмент гена, кодирующий последовательность от 947-го аминокислотного остатка до конца фермента CPSase. В качестве матрицы применяли плазмиду pBScarAB-13, а олигонуклеотиды carB-rand (PI) и M13-direct использовали как праймеры. Фиксированная 58 носледовательность из 21 нуклеотида на 3'-конце нраймера carB-rand гомологична последовате

синтезирующих активную NAGS в клетках

2.5.1. Отбор вариантов, Е. соИ штамма TG1 Реципиентный штамм Е. coli TGI был трансформирован лигазной смесью библиотеки рекомбинантных плазмид. Отбор клеток, содержащих плазмиду рККargA-random с функциональным мутантом, нроводился на чашках с агаризованной средой LB. Среди всех клонов штамма TG1 (pKKArgA-random) нами были обнаружены несколько более "прозрачных" колоний, имеющих также меньший размер по сравнению с колониями штамма TG1 (pKK

2.5.2. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках Е.соПВ16-4 Реципиентный штамм В16-4 был трансформирован лигазной смесью библиотеки рекомбинантных нлазмид. Рекомбинантные клоны с агаризованной чашки были ресуспендированы в минимальной среде М9, содержащей 5 г/л Lаргинина, и выращивались до ноздней стационарной фазы (24 ч). Часть культуры (1/1000 V) была ресуспендирована в свежей среде М9 (5 г/л Arg) и процедура была повторена еще четыре раза. После чего культура была рассеяна на

2.5.3. Отбор вариантов, синтезирующих активную CPSase Первая стадия селекции. Совокунностью рекомбинантных плазмид pELcarAB-NN, выделенных из нула клопов TGl(pEL-carAB-NN), трансформировали клетки E.coli В-6969(саг5::Тп10). Трансформационную смесь высевали на чашки с 60 агаризованной средой М9 для отбора клонов, продуцирующих активный белок СагАВ. Вторая стадия селекции. Активность и устойчивость CPSase к UMP в 50 хорошо растущих рекомбинантных клонах оценивали с помощью реакции B6969(car5::T

Очистка мутантньк белков NAGS и белка дикого типа проводилась согласно методике, описанной Marvil и Leisinger (Marvil and Leisinger, 1977), и включала следующие шаги: Шаг 1: 10 мл ночной культуры штамма TG1, содержащего плазмиду pICKArgA-wt или pKKArgA-rll, -г 13 или -4 было использовано для засева 200 мл LB (засев проводился в колбу 1 л). При достижении каждой культурой оптической плотности ОП55о=1 о.е., она была индуцирована 1 мМ IPTG (isopropyl-P-Dthiogalactopyranoside) и подращивалась при

Для определения активности NAGS, клетки Е. соИ штамма В3083, содержащие рекомбинантную плазмиду, были выращены на минимальной среде М9 (5

мл) до поздней экспоненциальной фазы, промыты 0,14 М раствором NaCl, и ресуспендированы в 2 мл 40 мМ калий-фосфатного буфера (рП 7,0) содержащего 100 мМ КС1. Клетки были разрушены ультразвуком и центрифугированы. Фракция, содержащая белок NAGS была осаждена 5 объемами насыщенного раствора (NH4)2SO4 и осадок растворен в 2 мл 40 мМ калий-фосфатного буфе

2.7.2. Анализ ферментативной активности мутантных CPSase Грубые клеточные экстракты 9 клонов B6969(car5::TnlO)(pEL-carAB-NN) и клона B6969(car5::TnlO)(pEL-carAB-6) были получены обработкой ультразвуком 64 20 мг влажных клеток, суспендированных в 0,5 мл буфера А (200 мМ фосфата калия, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 1 мМ ДТТ). Фракции белков, содержащих CPSase, осаждали раствором сульфата аммония (35-65% насыщения, 10 мин при 4°). Осадок белков растворяли в 1 мл буфера В (20 мМ фосфата калия, рН

В основе метода комбинаторного мутагенеза лежит идея о возможности компенсировать негативное влияние одной аминокислотной замены на активность фермента за счет одновременного изменения нескольких соседних аминокислотных остатков (Птицын Л. Р. и соавт., 1998). Количество варьируемых аминокислот зависит от конкретного белка и должно определяется опытным путем или на основе структурного анализа исследуемого белка (если это возможно). С методической точки зрения, для реализации данного метода не

. В качестве первого объекта для модификации методом комбинаторного мутагенеза в данной работе был использован фермент катализирующий первую реакцию в пути NAGS из Е. соИ, аргинина. интактного гена в биосинтеза Ретроингибирование этого фермента аргинином создает серьезные проблемы на нути создания высокоэффективного штамма-продуцента этой аминокислоты. Ранее были локализованы две fbr мутации (Hisl5Tyr, Tyrl9Cys) NAGS, присутствие которых существенно снижало удельную активность фермента {Raj

Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA проводили согласпо методу комбинаторного мутагенеза, Методах (см. разд.

2.4.1.). pUC19-ArgA, несущая как описано в Материалах и \ В качестве матрицы была использована плазмида ген argA, а в качестве праймеров интактный олигонуклеотиды Р1: 5 '-cgagggattccgcNNNNNNNNNNNNNNNatcaatacccaccggg-3', частично комплементарный последовательности гена argA; Р2, комплиментарный последовательности плазмидного вектора расположенной downstream

3.2.2. Селекция "активных вариантов" мутантных ферментов NAGS в клетках Е.соИ штамма TG1. Среди всех клонов штамма TG1 (pKKArgA-random) нами были обнаружены несколько более "прозрачных" колоний, имеюш;их также меньший размер по сравнению с колониями штамма TG1 (pKXArgA-wt) (в среднем на 10 колоний нормального размера приходилась одна мелкая). Мы предположили, что этот эффект может быть связан с суперэкспрессией гена, кодирующего высокоактивный У&г-фермент NAGS. В даль

3.2.3. Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках штамма В16-4. Согласно литературным данным, активные fbr мутанты NAGS могут быть селектированы в штамме Е.соИ В16-4 argD,proBA {Eckhardt and Leisinger,1975). Этот штамм является ауксотрофом по пролину, и, следовательно, не может расти на минимальной среде без добавления этой аминокислоты. Штамм, содержащий fbr мутант NAGS, снособен расти на минимальной среде, так как глутамат-5полуальдегид, предшественник L-пролина, может быть синтезирован, х

3.2.4. Активности мутантных ферментов в клеточных экстрактах. Для оценки активности мутантных NAGS клеточные экстракты штамма Е.соИ B3083(argA"), несущего рекомбинантные нлазмиды, были обогащены осаждением в 80% растворе сульфата аммония. Активность NAGS оценивали в реакции биосинтеза N-ацетилглутамата в нрисутствии 5 мМ L-аргинина и в его отсутствии: NAGS L-глутамат+ацетил-СоА • N-ацетил- L-глутамат + СоА В каждом случае в качестве контрольного раствора использовали такую же реакционну

. Был осуществлен электрофорез мутантньгх белков NAGS в ПААГ в денатурирующих условиях по методу Laemmli {Laemmli, 1970). Анализ профиля белков грубых клеточных лизатов полученных плазмидных штаммов существенные различия в количестве синтезированных выявил рекомбинантных ферментов (рис.

3.2). В то время как уровень экспрессии белка NAGS-rl3 и, в меньшей степени, NAGS-4, были сравнимы с NAGS-wt, зоны мутантньгх белков NAGS-rll, NAGS-rl2, NAGS-r20 и NAGS-r32 были существенно менее NAGS

3.2.6. Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штамма-продуцента аргинина Так как ацетилирование глутамата является ключевой стадией биосинтеза аргинина, мы использовали сконструированные Jbr мутанты фермента NAGS в штамме-продуценте аргинина В7925 (ilvA::Tn5, argR). Данный штамм содержит 78 точечную мутацию в гене argR (Glyl23Asp), что приводит к его инактивации, и, следовательно, к активированию всего нути биосинтеза аргинина. Таблица

3.4. Синтез аргинина в штамме

3.3. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из Е. со// Вторым обьектом нашего исследования стала CPSase из Е. соИ, являющаяся ключевым пиримидинов. ферментом сразу для двух путей биосинтеза аргинина и Этот фермент представляет собой гетеродимер, состоящий из малой (41270

Да) и большой (117710

Да) субъединиц, которые кодируются генами сагА и сагВ, соответственно. Малая субъединица фермента катализирует гидроли

. Процесс конструирования библиотеки мутантных генов сагВ проходил аналогично конструированию совокупности мутантных генов argA. В качестве матрицы была использована плазмида pBScarAB-13, а в качестве праймеров - Р1: 5'-ggtcgtgcgctgNN(T/C)N(T/C)CNN(T/C)NNN(G/A)NN-ggcgataaagaacgcgtggtg -3', частично комплемептарный последовательности гена сагВ, Р2 - прямой праймер М13 иРЗ: 5'-ccacttcctcgatgacgcgg-3', гомологичный 5'-концу гена саг5. Частичная рандомизация 15-нуклеотидного фрагмента гена сагВ,

3.2. Селекция fbr мутантов CPSase. На первом этапе селекции для отбора клонов, продуцирующих активные варианты CPSase, совокупностью рекомбинантных плазмид pEL-carAB-NN трансформировали клетки Е.соИ штамма В6969(саг5::Тп10). Трансформационную смесь высевали на чашки с агаризованной средой М9. В результате была выявлена группа хорошо растущих рекомбинаптных клонов, 50 из которых использовали для второго и третьего этапов селекции, на которых проводили скрининг отобранных вариантов путем оценк