Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71705

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

1.3. Транскрипция мтДНК и процессинг РНК Первые работы но изучению транскринции мтДНК проводились более 20 лет назад на культурах клеток человека и мыши и на этих данных базировались основные нредставления. В этих работах была характеризована структура, видовая идентичность и метаболитические свойства митохондриальной РНК [Montoya et al. 1982, 1983; Walberg and Clayton, 1983; Chang and Clayton, 1984; Yoza and Bogenhagen, 1984], a также были определены цис-активные элементы, необходимые для тр

1.5. Нуклеазная активность в митохондриях Митохондрии млекопитаюших обладают сильной эндонуклеазной активностью, которая проявляется при нарушении мембранного потенциала т.е. разрушении митохондрий. Наибольший вклад в нуклеазную активность митохондрий вносит Эндов млекопитаюших, белок кодируется в ядре и представляет собой 33 кДа зимоген с N концевым 48 аминокислотным остатком, который отрезается после транслокации белка в митохондрии и в митохондриях локализуется 29 кДа форма нуклеазы [Prats

1.6. Митохондриальная РТР в митохондриях существуют процессы неспецифического переноса метаболитов и макромолекул. Среди них можно отметить механизмы транспорта, движущей силой которых является потенциал на внутренней митохондриальной мембране, который не позволяет осуществляться транспорту молекул в матрикс и из него пассивным способом. Для осуществления обмена на внутренней мембране митохондрий существует сложный белковый комплекс, называемый РТР (permeability transition pore). Из-за чувств

.

в нормальной метаболизирующей клетке мтДНК, как и яДНК, постоянно подвержена окислению, «спонтанной» тепловой и гидролитической деградации, а также неферментативному метилированию [Lindahl, 1993] При взаимодействии АФК с ДНК образуют разнообразные химически стабильные структурные повреждения. К ним можно отнести модификацию оснований, потерю оснований (АПсайты), однонитевые разрывы или более сложные повреждения типа межнитевых поперечных сшивок и двунитевых разрывов. Большая часть окислительн

2.2.Структура и принцип действия антибиотика блеомицина. Блеомицин - это общее название группы структурно близких гликопептидьк антибиотиков, продуцируемых микроорганизмом Streptomyces xerticullus. Эта группа делится на две подгруппы - блеомицин А и блеомицин Б, каждая из которых, в свою очередь насчитывает от пяти до щести близких по структуре антибиотиков. Они щироко используются в медицине при лечении злокачественных новообразований. Принцип их действия основан на способности вызывать в пр

Глава 1. Материалы и методы

Все экспериментальные данные, описанные в работе, получены на мышах линий BALB/c и С57Ь1, содержащихся в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН.

Облучение в дозах 3, 5, 8, 10 Гр проводили на установке ГУБЕ (Со), мыщей мощность облучения -

1.8 Гр/мин, и на установке РУТ 250-15-1, мощность облучения 2 Гр/мин. Через определенные сроки после облучения физ. раствором и использовали в экспериментах. декапитировали, извлеченные ткани (печень, мозг, селезенка) промывали холодным

Митохондрии выделяли из мозга мыщей методом Брустовецикого и Дубински [Brustovetsky and Dubinsky 1999]. После декапитации мозг быстро извлекали и помещали в ледяную среду вьщеления (СВ), содержащую: маннит- 225 мМ, сахароза75 мМ, ЭГТА-1 мМ, бьиий сывороточный альбумин (БСА)-

0.1%, HEPES-10 мМ, рН

7.4. Изолированный мозг промывали 2-3 раза в ледяной среде СВ, затем измельчали хирургическими ножницами в чашке Петри с небольщим количеством СВ. Измельченную ткань помещали в стеклянный

1.4. Измерение скорости потребления 02 в суспензии изолированных митохондрий мозга. Измерение скорости потребления Ог проводили при 28 "С в термостатируемой ячейке с перемешиванием в среде содержащей: маннит- 215 мМ, сахароза- 50 мМ, KCL-10 мМ, КН2РО4-1 мМ, MgCL2-

0.5 мМ, HEPES-10 мМ, рН-

7.4. Концентрация митохондрий в ячейке во всех экснернментах составляла 1мг белка/1мл. Объем ячейки равен

2.5 мл. Потребление О2 митохондриями измеряли нолярографически с использовани

1.6. Выделение ЦНК

. К 300 мкл фракции митохондрий добавляли 300 мкл лизирующего раствора: (4 М гуанидинтиоционат, 25 мМ натрий цитрат [рП

7.0],

0.5% саркозил), неремешивали, вносили 15 мкл 2М трис-ПС1, рН

8.0, 30 мкл 4М NaCI, 600 мкл фенола, насыщенного трис-НС1, рН

8.0,120 мкл хлороформа, гомогенезировали, оставляли в холодильнике на 20 минут, после чего центрифугировали в течение 3 минут при 6000 об/мин, на центрифуге Eppendorf 5415. Отбирали верхнюю фазу, добавляли два объема 96% эта

ДНК цитозольной фракции вьщеляли сорбцией на мапштных сорбентах. Цитозольную фракцию смешивали с равным объемом лизирующего буфера, содержашего: 4М гуанидинтиоционат, 25 мМ натрий цитрат (рН

7.0),

0.5% саркозил . К аликвоте лизата добавляли 1/10 объема 1М трис-НС1 рН

8.0, NaCI до конечной концентрации 1М и 1015 мкл магнитных сорбентов. После инкубации в течение 15 минут при 55''С проводили связывание мапштных сорбентов в магнитном поле. Элюцию ДНК с сорбентов осушествляли в

Выделение РНК осуществляли по методу, описанному Хомчинским и Сачи (Chomczynski and Sacchi, 1987). К ткани добавляли 10 объемов лизирующего буфера, содержащего 4М гуанидина тиоцианата, 25мМ натрия цитрата, 0,5% лауроилсаркозила, 0,1М бета-меркаптоэтанола и гомогенизировали при комнатной температуре. К гомогенату последовательно добавляли 1/10 объема ЗМ AcONa, рН

5.0. После перемешивания добавляли 1 часть водонасыщенного (кислого) фенола. Добавляли 1/5 объема смеси хлороформ-нзоамиловый

к ткани добавляли 10 объемов лизирующего буфера, содержащего 4М гуанидина тиоцианата, 25мМ натрия цитрата, 0,5% лауроилсаркозила, 0,1М бета- меркаптоэтанола. Инкубировали при комнатной темнературе 30 минут. К лизату добавляли Трис-НС1 рН 7,5 до конечной концентрации 100 мМ и хлорид натрия до конечной концентрации 300 мМ. К полученной смеси добавляли 50 мкл силиконизированных магнитных частиц. Инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Пробирку устанавливали в магнитный щтатив. Жидко

Вьщеление полноразмерной мРНК из тотальной РНК проводили по следующей процедуре: к аликвоте раствора тотальной РНК добавляли 250 нМ биотин - меченного oligo-d(T) праймера. Инкубировали 5 минут при +70°С. Пробирку с раствором помещали в лед и добавляли 15 мкл магнитных частиц, покрытых стрентавидином. Инкубировали 10 минут при комнатной температуре, периодически перемешивая. Используя магнитный щтатив, отбирали жидкость. Магнитные частицы трижды промывали холодным промывочным буфером, содержащ

1.8. Синтез первой цепи кДНК Синтез первой цепи кДНК осуществляли по следующей процедуре: смешивали 2 мкл мРНК и 1 мкл oligo-d(T)ig праймера. Инкубировали 5 минут при +70^С. Помещали в лед. Добавляли буфер содержащий ЮмМ Tris-HCl рН

8.3, 50 мМ КС1, 0,2 мМ dNTPs, 1,6 мМ Mg^"^, перемешивали. К смеси добавляли 1 мкл RNAsin^^ (Fermentas) и 1 мкл (200 ед.) H-Minus^^ M-MuLv обратной транскриптазы (Fermentas). Смесь инкубировали 30 минут при +40°С. Реакцию останавливали нагреванием при 95

1.9. Полимеразная цепная реакция [ПЦР] ПЦР проводили в объеме 20 мкл в буфере, содержащем ЮмМ Tris-HCl рН

8.3, 50 мМ КС1, 0,2 мМ dNTPs, 1,6 мМ Mg^*, 250 нМ каждого праймера, 2 единицы Taq ДНК полимеразы для низкомолекулярных фрагментов (1841п.н. и ниже) и 2 единицы Taq/Pfu ДНК полимеразы в соотношении 2ед Taq полимеразы и 0,4ед Pfu полимеразы для высокомолекулярных фрагментов (больше чем 1841 п.н.). Амплификацию фрагментов проводили с праймерами, указанными в таблице 2: Таблица 2, Пра

Для точной количественной оценки содержания фрагментов нуклеиновых кислот использовали ПЦР-РВ (для оценки количества ДНК) и ОТПЦР-РВ (для оценки количества мРНК). ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ проводили с использованием систем для детекции ПЦР - продуктов в реальном времени: АНК-16 (ИАП РАН, Синтол), МХЗООО (Stratagene), IQ5 (Bio-Rad). Система ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ включала технологию TaqMan, основанную на 5'-экзонуклеазной активности Го^-полимеразы. Зонды были 45 помечены флуорофором на 5' конце и тушителем

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) - это семейство методик количественного ПЦР со следующими чертами: 1. Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации. 2. 3. Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой. Для детекции ПЦР-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Меха

1.10. Определние нуклеазной активности Нри онределении нуклеазной активности митохондриального матрикса клеток головного мозга и селезенки мышей митохондрии, вьщеленные из контрольных и облученных животных, лизировались в буфере (10 мМ Tris НС1, рН

7.4). После осаждения нерастворившихся частиц нри ускорении 10000 g в течение 10 мин 10 мкл лизата инкубировали с 5 мкг высокомолекулярной ДНК тимуса теленка в течение 12 час при 37°С в буфере, содержашем ЮмМ Tris-HCl рН

7.4, 50 мМ КС1,

1.11. Определение активности цитратсинтазы. Активность цитратсинтазы определяли в супернатанте (модельная система) и цитозольной фракции клеток головного мозга. Являясь ферментом митохондриального матрикса, активность цитратсинтазы характеризует целостность митохондрий. Для определения активности цитратсинтазы использовали метод Срере [Srere, 1969]. Реакцию проводили в обьеме 200 мкл: 100 мМ Tris-Hcl (рН 8,35), 5 мМ 5,5-дитиобис(2нитробензоат) (DTNB), 22,5 мМ ацетилкоэнзима А (acetyl-CoA), 25

2.1.Биогенез мтДНКв ответ на действие облучения и блеомицина. в данной работе количество копий мтДНК соотносится с единицей однокопийного ядерного гена (gapdh, beta-actin). Такой подход мы считаем максимально корректным, поскольку 1 копия однокопийного ядерного гена по сути и представляет клетку, а все количественные потери в процедуре выделения тотальной ДНК в равной степени затрагивают как митохондриальную, так и ядерную ДНК. Известно, что критический цикл амплификации фрагментов ДНК в НЦР

. X I о 10 9876 5 4 32- • л. • селезенка головной мозг Рис.9 Уровень мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей. Значки нредставляют собой индивидуальные зиачення. Амнлификаиия фрагмента гена nd6, нормализация но gapdh. Известно, что в клетках разных тканей количество митохондрий и количество копий мтДНК в них варьирует в широких пределах: от нескольких единиц до десятков тысяч. На рис.9 приведены результаты исследования количества копий мтДНК в тканях контрольны

Известна чрезвычайно высокая степень повреждения мтДНК при действии ионизирующих излучений. В данной работе исследовались процессы репликации мтДНК в клетках головного мозга и селезенки мышей в условиях сильного повреждения матрицы. На рис.10 приведены результаты исследования процессов репликации мтДНК клеток головного мозга и селезенки при гаммаоблучении мыщей в дозе 5 Гр. 53 900 800 q; 700 Ф 600 Головной мозг т

1.2- Селезенка JE 500 О 400 of 300200100i f т/\ \ \ Ч

0.8- 5

. Для исследования физиологического уровня митохондриальной мРНК мы оценивали количество копий мРНК трех митохондриальных генов: nd4, соП и nd6. Для определения эффективности амплификации и обратной транскрипции в триплексной системе использовали два ядерных однокопийных, конститутивно экспрессируюшихся гена: gapdh и beta-acin. Данные представлены на рис.11. Для определения эффективности ПЦР, нами был использован метод кратных (порядковых) разведений кДНК, получепной из мРНК (в случае относит

По современным представлениям процессы репликации и транскринции мтДНК взаимосвязаны. Например: для репликации Н-цепи необходимы короткие РНК праймеры, получающиеся в результате процессинга транскринтов промотора L-цепи. Следовательно ренликация мтДНК зависит от транскрипции [Clayton, 1992]. Мы исследовали транскрипцию трех митохондриальных генов: nd4, соП и nd6 в клетках головного мозга и селезенки облученных в дозе 10 Гр мышей. Следует отметить, что первые два гена входят в состав тяжелой ц

Принцип действия блеомицина основан на способности вызывать в присутствии ионов Fe2+ многочисленные однои двунитевые разрывы в структуре молекулы ДНК подобно тому, как это делают свободные радикалы, образующиеся при действии ионизирующей радиации или химических агентов. Результаты исследования транскрипции трех митохондриальных генов: nd4, соП и nd6 в клетках головного мозга и селезенки мышей после инъекции предельной дозы блеомицина [1,5 мг/мышь] совпадают с результатами, полученными при дей

2.2. Элиминация фрагментов мтДНК. Анализируя уровень экснрессии генов nd4, nd6 и соП в клетках головного мозга и селезенки облученных мышей мы пришли к выводу, что при действии ИР в мтДНК образуются крупные делеции размером, приблизительно 5 т.п.н. Поскольку митохондрии в данном случае не утрачивают своей целостности (см. далее) и физиологического статуса, возможны 2 процесса, позволяющие утилизировать большие фрагмент мтДНК: 1 - фрагменты могут быть выведены за пределы органеллы и 2 - фрагме

. В современной научной литературе отсутствуют какие-либо данные о феномене выхода ДНК из митохондрий и, тем более, механизмах, задействованных в этом процессе. Однако, многие исследователи обсуждают процессы белкового переноса в митохондрии. Как уже было описано выше, митохондриальная ДНК кодирует 13 полипептидов, входящих в структуру электрон-транспортной цепи. Для функционирования ЭТЦ необходимо более 1000 полипептидов. Ясно, что должен существовать механизм 69 переноса белков, кодирующи

. Процессы повреждения, а значит и фрагментации мтДНК, могут происходить при воздействии жестких химических и физических агентов на организм. Например: при гамма-облучении животных уровень свободных радикалов многократно возрастает, что способствует индуцируется открытию РТР, поскольку митохондриальная РТР окислительно-восстановительных реакций и многими продуктами продуктами реакций, в которых образуются радикалы [Constantini Р, et al., 1995, Kowaltowski et al., 1995, Petrolini et al., 1

2.3 Функциональное состояние митохондрий тканей облученных мышей Возможен ли процесс открытия РТР при гамма-облучении Изменяются ли физиологические показатели митохопдрий животных? при радиационном воздействии на мышей в летальных дозах? Мы попытались ответить на эти вопросы. Одпим из значительных параметров функциональной активности митохондрий является их способность аккумулировать ионы кальция, в том случае, когда их концентрация в цитозоле является нефизиологической. Органелла обладает

Нами была исследована нуклеазная активность лизатов митохондриального матрикса головного мозга и селезенки контрольньк и облученных в дозе 5 Гр мышей. На Рис. 28 представлены результаты электрофоретического разделения ДНК тимуса теленка, подвергшейся деградации нуклеазами митохондриального матрикса. Через 24 часа после облучения проявляется нуклеазная активноть митохондриального матрикса. Следует отметить, что в митохондриях головного мозга нуклеазная активность матрикса практически не уступа