Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы Streptomyces aureofaciens : диссертация ... кандидата химических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71510

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

3) изучение влияния замен остатков активного центра РНКазы Sa на конформационную стабильность фермента;

4) исследование цитотоксических свойств РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с обращенным зарядом, оценка влияния отдельных клеточных компонент на цитотоксические эффекты, проявляемые РНКазами. 1. Рибонуклеаза Sa, родственные ферменты и их ингибиторы (Обзор литературы)

Все ферменты, участвующие в расщеплении нуклеиновых кислот, называются нуклеазами. К ним относятся ферменты, специфичные к ДНК - ДНКазы, к РНК РНКазы и семейство ферментов, которые могут расщеплять оба субстрата - нуклеазы. Исходя из представлений о механизме действия нуклеаз, Бернард [12] подразделял РНКазы на две группы: фосфотрансферазы (циклизующие РНКазы) и фосфогидролазы. Фосфотрансферазы используют 2'-0Н группу рибозы нуклеотида для внутримолекулярной атаки на примыкающий атом фосфора.

РНКаза Sa была первой внеклеточной рибонуклеазой, вьщеленной из ростовой среды микроорганизма Streptomyces aureofaciens, штамм ВМК [20]. Этот фермент содержит 96 аминокислотных остатков, одну дисульфидную связь и не содержит остатков метионина, лизина или триптофана. РНКаза Sa из стрептомицетов относится к подсемейству микробных РНКаз семейства Ti [21]. Позже были выделены два изозима РНКазы Sa из других штаммов Streptomyces aureofaciens, РНКаза Sa2 (штамм R8/26) и РНКаза Sa3 (штамм ССМ 3239)

Кристаллическая структура нативного фермента была определена первоначально с разрешением 1,8 А [25], затем с разрешением 1,2 А [26], а недавно с разрешением 1,0 А [10]. В настоящее время структура фермента определена также в растворе методом ЯМР [11]. Гомология первичной структуры РНКазы Sa с первичными структурами РНКазы Sa2, Sa3, биназы и барназы составляет 56%, 69%, 24% и 23%, соответственно (рис. 2). Различия в пространственном расположении полипептидных цепей РНКазы Sa и Sa3 наблюдаются

РНКаза Sa является гуанилспецифичной рибонуклеазой. Гуаниловые РНКазы — это РНКазы, которые расщепляют фосфодиэфирные связи на ОЗ'-конце гуанозиновых нуклеозидов РНК с образованием олигонуклеотидов с гуанозин-2',3'-циклофосфатом на З'-конце и гидроксильной группой на 5'-конце. Гуанозин-2',3'-циклофосфат гидролизуется гуаниловыми РНКазами с образованием гуанозин-З'-фосфата. Поэтому в качестве субстратов для изучения и сравнения свойств таких РНКаз используются гуанозин-2',3'-циклофосфат, GpN д

В настоящее время РНКаза Sa широко используется как модельная система для изучения фолдинга белка [35-37]. При этом одним из основных методов исследования является денатурация фермента. Н. Пэйс с сотр. изучал термодинамическую стабильность РНКаз Sa, Sa2 и Sa3 [36]. При рН 7,0 РНКаза Sa более термостабильна, чем РНКазы Sa2 и Sa3, но уступает в стабильности барназе и РНКазе Ть Температуры денатурации РНКаз Sa, Sa2, Sa3, Ti и барназы при рН 7,0 равны 48,4, 41,1, 47,2, 51,6 и -U 53,2°С, соответс

Молекулярные недостаточно. механизмы стабилизации белков до сих пор изучены с С одной стороны, белки стремятся принять конформацию минимальной свободной энергией. С другой, если белок является ферментом, то он должен обладать конформационной подвижностью, необходимой для специфического связывания субстрата и принятия необходимой ориентации каталитических групп [46]. Было показано, что активный центр фермента действительно обычно более конформационно подвижен, чем остальная часть его молекулы

Традиционно конструирование ингибиторов рибонуклеаз было связано с нейтрализацией их активности при биохимических работах с РНК-содержащими препаратами. Использование для этих целей белкового цитоплазматического ингибитора (RI) ограничено с одной стороны его ингибирующим действием только в отношении РНКаз панкреатического типа, принадлежащих к семейству РНКазы А. С другой стороны, даже в этом случае его использование часто малоэффективно из-за необратимой денатурации ингибитора в условиях экс

В 1965 г. Смитон и др. [63] обнаружили, что штамм Bacillus amyloliquefaciens продуцирует внутриклеточный белковый ингибитор, предохраняющий клетку от летального действия собственной рибонуклеазы. Позже этот белок получил название барстар. Клонирование и экспрессия гена этого белка в Е. соН создали основу для изучения структуры и механизма действия барстара с помощью методов белковой инженерии [64]. Молекула барстара (Мг=10213Да) состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 89 аминокислотны

2.2. Цитоплазматический происхождения Ткани млекопитающих содержат цитоплазматический белковый ингибитор рибонуклеаз (RI) панкреатического типа. Впервые

заключение о существовании такого ингибитора было сделано в 1952 г. из увеличения РНКазной активности в надосадочном растворе печени после подкисления. Детальное изучение цитоплазматического ингибитора началось в конце 70-х годов с развитием методов получения препаративных количеств гомогенного белка, достаточных для физикохимиче

1.6. Цитотоисичность РНКаз Некоторые РНКазы токсичны для клеток млекопитающих, особенно для опухолевых клеток. Действительно, секретируемые микробные РНКазы не только обеспечивают клетки хозяина доступным источником фосфора, который образуется при разложении РНК нежизнеспособных клеток, но и служат оружием в конкурентной борьбе с другими микроорганизмами за экологическую нишу [9]. РНКазы высших организмов составляют важный компонент иммунной защиты. Так, кожа человека обладает РНКазной активн

Знание того, как РНКаза реализует свою цитотоксичность, необходимо для повышения ее токсического действия на раковые клетки. Важным параметром цитотоксичности РНКаз является избирательность их токсического действия по отношению к нормальным и опухолевым клеткам. Очевидно, что большая чувствительность раковых клеток к действию РНКаз связана с особенностью их жизнедеятельности и/или наличием клеточных компонент, отличающих их от нормальных клеток. Поэтому представляется необходимым выявление та

а) Рибонуклеазы Sa, Sa2, Sa3 и мутанты РНКазы Sa. Экспрессионные формы РНКаз Sa, Sa2, Sa3 и мутантов РНКазы Sa Q38A, Е41К, E54Q, R65A, Е74К, H85Q, ЗК (D1K, D17K, Е41К) и 5К (3K+D25K, Е74К) были получены при совместной работе с сотрудниками отдела медицинской биохимии и генетики Техасского А&М университета (США) по методикам, разработанным в этом отделе [23, 35, 45]. Плазмиды рЕНЮО для РНКазы Sa, рЕН200 для РНКазы Sa2 и рЕНЗОО для РНКазы Sa3 были созданы на основе экспрессионного вектора р

Гены мутантных барстаров конструировали при помощи метода ПЦР, используя в качестве ДНК-матрицы ген барстара А (С40А, С82А барстар). Таким образом, барстары с заменами D35A, D39A, Е76А и I87E являются мутантными производными барстара А. Нуклеотидную последовательность генов в составе экспрессионных векторов определяли по двум цепям ДНК. Экспрессию генов барстара А и его мутантов проводили в составе вектора pGEMEX-1 в штамме Е. соИ BL21(DE3). Работу проводили совместно с сотрудниками лаборатор

Препарат З'-Н-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфата (pT-3'-N- гидроксимочевина) был синтезирован в лаборатории проф. Р.Рэйнса (Университет Висконсин-Мэдисон, США) по Схеме 1. В качестве исходного был взят коммерческий реагент 3'-азидо-2'-дезокситимидин 5'-монофосфат (АЗТ-монофосфат). 3'-амино-2'-дезокситимидин 5'-монофосфат синтезировали следующим образом. АЗТ-монофосфат (50 мг, 135 цМ), трифенилфос(^н (PPha) (50 мг, 192

цМ) и тетрабутиламмониумфлуорид (TBAF) (0,10 г, 0,36

Субстраты для ферментативной кинетики ро1у(1) и GpU были получены от Sigma. Ацетат натрия, цитрат натрия и хлорид натрия были получены от Merck. Хлорид цинка был получен от ICN. Остальные реактивы были получены от Sigma. Для всех экспериментов использовали деионизованную воду (установка milli-Q, Millipore Inc., США).

Исследование кинетики гидролиза ро1у(1) и GpU рибонуклеазами проводили при 25°С и рН 6,5 или рН 6,2, в буферных растворах следующего состава: 0,05 М Трис-НС1, 0,1 М NaCl, 0,05 М ацетат натрия (рН 6,5); 0,1 М цитрат натрия, 0,1 М NaCl (рН 6,2). Начальные скорости реакции определяли спектрофотометрически на спектрофотометре V-560 ("Jasco" Япония) по изменению поглощения раствора на 248 им для ро1у(1) и 280 им для Ори, используя разностные молярные коэффициенты поглощения As=1330 М' 'с

Использовали две пары линий клеток в соответствии с предполагаемыми мишенями действия микробных РНКаз: (а) НЕК293 клетки почки эмбриона человека, в которых изначально отсутствуют активируемые кальцием калиевые каналы (Кса каналы), и те же клетки, трансфецированные генами Кса каналов hSK4 на вирусном векторе. В качестве контрольных клеток, не содержащих Кса каналов, во избежание влияния вирусного вектора на выживаемость клеток, использовали линию клеток HEKCV, сконструированную с помощью внесе

Измерения параметров тепловой денатурации белков Td и AHcai (температура денатурации и калориметрическая энтальпия денатурации, соответственно) проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО "Биоприбор", Пущино, Россия) при скорости нагрева 1 К/мин. Рабочий объём капиллярных калориметрических ячеек из платины составлял 0,48 мл. Для предотвращения образования пузырьков и закипания растворов при повышении температуры в ячейках калориметра поддерж

Спектры КД снимали на спектрополяриметре J-715 ("Jasco", Япония) в дальней УФ-области. Для измерений использовали специальные кварцевые кюветы с длиной оптического пути 0,1 см ("Hellma Cells", США). Концентрации белков составляли 0,150,30 мг/мл. Результаты измерений выражали в единицах молярной эллиптичности, [0] (град-см -дмоль"), приходящейся на средний аминокислотный остаток, считая среднюю массу остатка равной ПО для РНКазы Sa и ее Q38A, Е41К, E54Q, R65A, Е74К, H8

Константы диссоциации комплексов РНКаз с барстаром А и его производными определяли титрованием фермента ингибитором, используя в качестве субстрата ро1у(1) [68]. Измерения проводили в 10 мМ Na-ацетатном буфере с 50 мМ NaCl, рН 6,2, при 25°С. Растворы РНКазы в концентрации порядка 10"'°М объемом 2 мл в присутствии различных концентраций ингибитора инкубировали в течение 24 часов при температуре 25°С. Затем эти растворы помещали в спектрофотометрическую ячейку, добавляли ро1у(1) и измеряли

Концентрацию белков определяли спектрофотометрически на спектрофотометре V-560 ("Jasco", Япония), принимая молярный коэффициент экстинкции при 280 им равным 27411 М''см"' для биназы [124]. Концентрации РНКазы Sa и ее мутантов определяли, используя один и тот же коэффициент молярной экстинкции 8278=12300 М''см'' [23], так как в мутантных белках не было замен ароматических остатков, которые дают вклад в УФ спектр на длине волны 278 нм. Для РНКазы Sa2 использовали значение 8278=17

Небольшие размеры РНКазы Sa (96 аминокислотных остатков) определяют возможность ее использования в качестве модели для изучения взаимоотношений между структурой и функцией белка, определяющих эффективность действия фермента, и для исследования факторов, влияющих на конформационную стабильность белков в растворе. К настоящему времени с целью изучения указанных факторов на РНКазе Sa выполнен ряд работ [35-37]. В то же время, роль и вклады в каталитические свойства РНКазы Sa остатков активного ц

3.1.1. Роль остатков Gln38 и Glu41 в связывании субстрата Результаты измерений кинетических параметров, характеризующих реакцию гидролиза ро1у(1) РНКазой Sa и ее мутантами, представлены в табл. 7, Можно видеть, что активность мутанта GlnSSAla, выражаемая как отношение kcat/Км, в 13 раз ниже активности нативного фермента. Снижение активности обусловлено главным образом уменьшением молекулярной константы скорости kcat, при сравнительно небольшом возрастании величины Км. Наиболее вероятно, что з

3.1.2. Функциональная роль остатков Glu54, Агдб5, His85 и Glu74 Предположение о роли остатков Glu54, Arg65, и His85 было сделано, как уже сказано выше, на основании изучения гомологии первичных структур РНКазы Sa и других гуанил-специфичных РНКаз. Замены этих остатков, элиминирующие их возможные каталитические функции, приводят к резкому снижению активности РНКазы Sa (табл. 7). Мутация Glu54Gln вызывала уменьшение молекулярной каталитической константы в 356 раз, тогда как сродство к субстрату

РНКаза Sa дикого типа является кислым белком с изоточкой, р1, равной 3,5. Общий заряд молекулы белка при рН 7 равен примерно -7 единиц заряда [23]. Фермент содержит 7 остатков аспарагиновой кислоты, 5 остатков глутаминовой кислоты, 2 остатка гистидина, 5 аргинина и не содержит ни одного остатка лизина. При этом основное количество остатков дикарбоновых кислот расположено на поверхности белка. К ним относятся остатки Aspl, Asp 17, Asp25, Glu41 и Glu74. Боковые цепи этих остатков экспонированы

в последнее время усилился интерес к созданию эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКаз в связи с потенциальной возможностью использования их как противораковых, подавляющих активность ангиогенина, и противоаллергических, ингибирующих активность РНКаз эозинофилов человека, препаратов [6]. Новообразование сосудов, стимулируемое ангиогенином, основано на рибонуклеазной активности этого фермента [55]. Варианты ангиогенина с более высокой области рибонуклеазной опухоли является активностью

3.2.1. Ингибирование РНКаз металлохелатами Анализируя подходы ингибирования ферментов различных классов, мы обратили внимание на предложенный в последнее время подход к ингибированию сериновых протеаз. Он основан на способности белков связывать ионы двухвалентных металлов. Как известно, цинк занимает второе место в биологии среди наиболее распространенных переходных металлов и незаменим для жизни [136]. В клетках почти весь цинк связан с белками в виде двухвалентного иона цинка [137]. Несмотр

3.2.3. Ингибирование цинка(11) активности Glu54Gln мутанта РНКазы Sa З'-М-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфатом в присутствии Для подтверждения способа связывания ионов цинка в активном центре РНКазы мы исследовали ингибирование рТ-3'-N-гидроксимочевиной в присутствии ионов Zn^"^ активности мутанта РНКазы Sa, в котором остаток Glu54 заменен на остаток глутамина. Схема 2 предполагает, что связывание иона цинка реализуется при участии в качестве лигандов двух групп белка. В с

3.4. Цитотоисические свойства РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с измененным зарядом Некоторые РНКазы являются эффективными антивирусными агентами, проявляют цитотоксичность и генотоксичность. Интерес к изучению цитотоксичности РНКаз значительно возрос после обнаружения токсических свойств РНКаз по отношению к раковым клеткам. Было показано, что некоторые представители суперсемейства РНКазы А эффективны против экспериментальных опухолей и проявляют цитотоксичность по отношению к лини

Интернализация является, вероятно, основной стадией, лимитирующей цитотоксичность РНКаз. Проникновению положительно заряженных молекул белка в клетку может способствовать связывание с отрицательно заряженными группами на внешней поверхности цитоплазматической мембраны. Известно, что неопластические клетки, в отличие от нетрансформированных аналогов, содержат на внешней поверхности значительно больше кислых фосфолипидов и гликопротеинов. Поэтому реальный путь усиления токсичности РНКаз по отн

3.4.2. Роль активируемых кальцием калиевых (КСа) каналов в преодолении цитотоксичности, индуцированной РНКазами Функциональная активность ионных каналов отличается в нормальных и трансформированных клетках. "Больные" клетки характеризуются дисфункцией ионных каналов: это либо нерегулируемый ток ионов в опухолевых клетках, либо блокирование ионных каналов в некротических клетках. Известно, что Кса-каналы в фибробластах активируются митогенами, тогда как в клетках, трансформированньк