Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71508

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

15.4. Масс-спектрометрический анализ белковых препаратов

16. Методы структурных исследований

16.1. Спею1ры'Н-ЯМР

16.2. Получение двумерных и трехмерных гетроядерных ЯМР-спектров

17. Методы биологических исследований

3.2.

17.1. Анализ взаимодействия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica

3.2.

17.2. Определение токсичности рекомбинантных токсинов

3.2.

17.3. Определение константы ингибирования нейрональных нАХР рекомбинантным нейротоксином II и мутантными нейротоксинами

3.2.18. Построение молекулярных моделей

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

4.1. Конструирование гена нейротоксина II

4.2. Конструирование гена тиоредоксина

4.3. Экспрессирующие вектора и биосинтез рекомбинантных токсинов в прокариотической системе (£•. coli)

4.3.

1.1. Сборка экспрессирующей конструкции для наработки слитного белка тиоредоксин-нейротоксин II

4.3.

1.2. Биосинтез нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином

4.3.

1.3. Выделение и очистка гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II

4.3.

1.4. ЯМР-спектроскопия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II

4.3.

1.5. Биологические свойства гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II

4.3.

1.6. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

1.7. Анализ рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

Экспрессирующая конструкция для секреции рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

2.2. Секреция рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

2.3. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

2.4. Анализ рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

2.5. ЯМР-анализ рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

2.6. Анализ токсичности рекомбинантного нейротоксина II

4.3.

3.1. Биосинтез изотопно-меченых вариантов нейротоксина II

4.3.

Глава 1. СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТОКСИНОВ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор относится к классу лигандзависимых ионных каналов, встроенных в постсинаптическую мембрану нейронов, основной функцией которых является быстрая нейропередача /2,14/. Благодаря своей способности преобразовывать межклеточные сигналы, нАХР играет ключевую роль в развитии и возникновении ряда заболеваний центральной нервной ситемы, таких как шизофрения / 1 5 / , эпилепсия /6,16-19/, депрессия, никотиновая /7/ и алкогольная зависимости /8,9/, болезнь Альцгеймер

Передача электрических сигналов нервной клетки основана на изменении мембранного потенциала в результате прохождения ионов через управляемые ионные каналы. Ионы перемещаются за счёт энергии, запас которой создаётся благодаря работе Na* и К"" насоса, поддерживающего высокие градиенты концентрации на мембране нервной клетки. В состоянии покоя равновесный Л * потенциал равен -70 мВ / 2 4 / . При воздействии Г короткого деполяризующего импульса, в результате открытия лигандзависимых ио

НАХР в настоящее время один из наиболее изученных рецепторных белков, чему в немалой степени и как способствовало наличие таких высокоспецифичных эффективных нейротоксины несмотря лигандов, на % щ а. а а. а змей. Однако, широкое Типичные представители двух различньк семейств никотиновых рецепторов: мышечный а ^ М (а) и (б), и нейрональный а75 (в) и (г). Индексами Н и L обозначены высоко и низкоспецифичные участки двух а 1-субъединиц 1ые участки двух аьсуоъединиц соответственно. исполь

Яды животных содержат множество различных токсинов, обладающих высокой биологической активностью / 5 9 / . В последнее время были определены пространственные структуры большого количества токсинов из яда морских моллюсков Conus /60-74/. Основными компонентами яда Conns являются небольшие пептиды, длиной 12-30 аминокислотных остатков, называемые конотоксинами. По своей структуре и степени биологической активности они делятся на большие группы, среди которых можно выделить: а-конотоксины (2-пет

Нейротоксины являются основными белковыми составляющими ядов таких змей, как кобра, тигровая змея и морская змея. Змеиные нейротоксины подразделяются на два класса: постсинаптические (а-нейротоксины) и пресинаптические (Р-нейротоксины), в зависимости от механизма действия. Пресинаптические ацетилхолина из нейротоксины, обнаруженные в семействах змей Crotalidae, Elapidae, Hydrophiidae и Viperidae, блокируют высвобождение периферических холинергических синапсов. Постсинаптические нейротоксины,

1.6. Взаимодействие нейротоксинов с никотиновым ацетилхолиновым рецептором Как и а-конотоксины, а-нейротоксины являются высокоспецифичными лигандами никотиновых ацетилхолиновых рецепторов. Было замечено, что две группы а-нейротоксинов (короткие и длинные) проявляют различные биологические свойства по отношению к нАХР /100,101 / . Так, Servent и др.. /100/ одинаково ингибируют нАХР, тогда показали, что нейротоксины обоих типов эффективно мускульный как к нейрональным нАХР высоко специфичны л

Глава 2. ПОЛУЧЕНИЕ а-НЕИРОТОКСИНОВ IN VITRO

2.1.

Введение а-Нейротоксины из яда змей представляют собой небольшие белковые молекулы, состоящие из 60-75 аминокислотных остатков. Пространственная структура а-нейротоксинов стабилизирована 4-5 дисульфидными связями, что делает их молекулы стабильными и устойчивыми даже в условиях сильных кислот и высоких температур /134/. Однако именно наличие в молекулах а-нейротоксинов дисульфидных связей сильно затрудняет получение этих токсинов in

За последние 30 лет стало возможным проводить контролируемую высокоэффективную применение, как экспрессию для чужеродных белков в различных так и для продуцентах. Экспрессия белков в бактериях давно уже получила широкое фундаментальных исследований, коммерческих целей. Существует несколько причин, по которым для экспрессии чужеродных генов удобно использовать бактерии. Первая причина заключается в том, что выращивать бактерии несравненно проще, чем клетки высших организмов. Вторая, и самая гл

При прямой экспрессии конечным продуктом является полипептидная последовательность самого гена. В Е. coli для инициации трансляции 31 используется последовательность ATG, кодирующая остаток метионина. Этот кодон должен предшествовать кодирующей части гена, поэтому все продукты трансляции имеют на М-концс остаток метионина. При прямой экспрессии или экспрессии в составе гибрида рекомбинантные белки способны накапливаться в цитоплазме в значительных количествах - до 50% от общего белка. Однако

При прямой экспрессии в Е. соИ внутриклеточное накопление эукариотических белков может быть ограничено, вследствие чего они подвержены интенсивной протеолитической деградации. Альтернативным способом цитоплазматической экспрессии генов нейротоксинов является экспрессия в составе слитного гена с белками-носителями, связей. Технология способствующими образованию дисульфидных бактериального синтеза нейротоксинов в виде гибридов с другими белками пользуется в последнее время все больщей популяр

2.5. Секреция нейротоксинов в Е.соИ Для получения рекомбинантных нейротоксинов в миллиграммовых количествах можно использовать механизм секреции белков в Е. соН. Для этого к ТУ^концу экспрессируемого белка генно-инженерным способом пришивают так называемый лидерный или сигнальный пептид, к которому в бактериальной цитоплазме присоединяется специальная сигналраспознающяя частица (SRP). Далее, весь этот комплекс направляется к внутренней мембране Е.соН. В роли SRP могут выступать также специаль

В работе были использованы следующие реактивы: агар (Difco, США); агароза, аммоний сульфат, ацетат натрия, бактотриптон, бромистый этидий, дитиотреитол, дрожжевой экстракт, глицин, меркаптоэтанол, натриевая соль ампициллина, тетрациклин, фенилметилсульфонилфторид MgCb, (Sigma, США); (PMSF), хлорамфеникол, p-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ), КН2РО4, К2НРО4, NaCl, К,Н'-метилен-бис-акриламид, гуанидинхлорид, CaCl2x2H20, КС1, MnCl2x4H20, MgS04, (Merck, Германия); азид натрия, натриевая соль этилендиа

В работе были использованы след)Щ)щие штаммы : 1. Eschirichia Coli XL-1 Blue: endAl, HsdR17(rkm]^), supE44, thi-l,X' recAl, gyrA96. relAl. A(lac), [F', proAB, lacP, ZAMIS, TnlO'"] (Stratagene, США) /151/. 2. Eschirichia Coli Bl2\(JuiEi)pLysS\ FompThsdSB((rBmB*) gal dcm (DE3)pLysS Cm'(NoYSigene, США) /152/. 3. Eschirichia Coli BL21(DE3): FompThsdSeffrB'mB^) gal dcm (DE3) (Novagene, США) /152/. 4. Eschirichia Coli BL21: FompThsdSBffrimB^) gal dcm (Novagene, СШ[А) /152/. 5. суперкомпетентны

БИБЛИОТЕКА Для экспрессии гена нейротоксина II в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином (Тгх) использовали вектор на основе плазмиды pGEMEX-1 (Promega, США), и как промежуточный этап при сборке экспрессирующей конструкции - вектор pBluescript II SK(-) (Stratagene, США). Для экспрессии генов нейротоксина II и его мутантных вариантов с секрецией конечного продукта использовали вектор на основе плазмиды pGEMEX-1 (Promega, США).

Клетки Е. соИ выращивали в питательных средах LB, SOB, ТВ или М9 / 1 5 3 / , в зависимости от поставленной задачи. В методиках приготовления компетентных клеток и трансформации использовали питательную среду SOB (20 г/л бакто-триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 20 мМ глюкозы, 10 мМ NaCl,

2.5 мМ КС1, 10 мМ MgCb, 10 мМ MgS04). Для вьщеления плазмидной ДНК биомассу клеток наращивали в питательной среде LB (10 г/л бакто-триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl). Экспрессию генов

Олигонуклеотиды были синтезированы Н.С. Быстровым и С.К. Волковым в Учебно-Научном Центре ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. В качестве праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и циклических реакций, с помощью которых осуществлялось конструирование генов нейротоксина II векторов, были и его мутантных вариантов и содержащих их олигонуклеотиды, структура которых использованы приведена в табл.6. Последовательности всех праймеров составлялись с учетом частоты встречаемости кодо

3.2.1. Трансформация клеток Е, соИ плазмидной ДНК Приготовление компетентных клеток Е. соИ, а также их трансформацию плазмидной ДНК проводили по методике с использованием растворов RF1 и 10^2/154/.

3.2.

Несколько свежих колоний, вьфащенных на чашке со средой SOB, ресуспендировали в 1 мл среды SOB и засевали в 100 мл той же среды. Клетки инкубировали при 37°С и хорошей аэрации до достижения культурой ранней логарифмической фазы роста. Культуру переносили в пробирки и охлаждали во льду в течение 15 мин, затем осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 1000 g и 4°С и тщательно удаляли супернатант. Осадок ресуспендировали в 1/3 от исходного объема клеточной суспензии буфера RF1: ЮОмМ LiCl,

К 200 мкл компетентных клеток добавляли 5-20 нг плазмидной ДНК, хорошо перемешивали и инкубировали во льду в течение 30 мин. Затем клетки подвергали тепловому шоку в течение 90 сек при 42°С, после чего вновь помещали в лед и инкубировали 4-5 мин. К клеточной суспензии добавляли 300 мкл среды SOB и растили в течение 60 мин при 37°С и хорошей аэрации. Затем клетки высевали по 100 мкл на чашки с селективной средой.

Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора "QIAprep Spin Miniprep Kit" (QIAGEN, Германия). Все манипуляции осуществляли согласно протоколу фирмы изготовителя. Выход ДНК с 5 мл ночной культуры составлял примерно 10 мкг.

Электрофоретический анализ плазмидной ДНК и ее фрагментов проводили в

0.8-

1.2% агарозных гелях в присутствии бромистого этидия с конечной концентрации

0.5 мкг/мл /153/. Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 3-6 В/см, в качестве электродного буфера использовался трис-боратный буфер (89 мМ трис, 89 мМ борной кислоты,

2.5 мМ ЭДТА, рН

8.2). По окончании электрофореза пластину просматривали в трансиллюминаторе ATM (BioTecMed, Швеция).

Количественные

1) определения и

2) препаратов путем ДНК проводили интенсивности спектрофотометрически сравнения флуоресценции бромистого этидия в исследуемом образце и в стандартном образце с известной концентрацией /153/. В первом случае измеряли поглощение растворов при длине волны 260 нм, что позволяло рассчитать концентрацию ДНК в образце. При этом считали, что оптическая плотность D=l соответствует 50 мкг/мл двуцепочечной ДНК и 20 мкг/мл олигонуклеотидов. С помощью отношен

Выделения плазмидной, а также фрагментированной ДНК из агарозных гелей проводили согласно инструкции к набору по очистке "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Германия).

Введение кодирующих пептидные фрагменты олигонуклеотидов в ген нейротоксина II с помощью сайт-направленного мутагенеза проводили согласно рекомендациям протокола фирмы-изготовителя (QuikChange, Stratagene, США). Реакционная смесь в объеме 50 мкл содержала 50 нг матричной (плазмидной) ДНК, по 125 нг олигонуклеотидных праймеров, по 10 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и

2.5 ед. акт. Pfu 46 даК-полимеразы. Проводили 20 циклов реакции амплификации по следующей

Для проведения ПЦР использовали праймеры, приведенные в табл.7. Реакционная смесь в объеме 50 мкл содержала 1 пмоль матричной ДНК, по 10 пмоль праймеров, по 10 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и 1 ед. акт. Р/и ДНК-полимеразы в буфере для Р/м-полимеразы: 20 мМ Трис-НС1, рН

8.75, 2 мМ MgS04, 10 мМ КС1, 10 мМ (NH4)2S04,

0.1 % тритон Х-100, 200 мкг/мл бьгаьего сывороточного альбумина. Цикл амплификации включал в себя денатурацию ДНК при 95 °С (1 мин), отжиг при 56°

3.2.8. Экспрессия гена нейротоксина II в виде слитной полипептидной цепи с геном тиоредокснна Клетки штамма Е. соИ BL2\(jyE3){pLysS) трансформировали рекомбинантным вектором и рассевали на чашки с антибиотиками: ампициллином и хлорамфениколом. Для наращивания клеточной массы с поверхности чашек собирали примерно

0.5-

2.0 колонии/мл и суспендировали 47 их в среде ТВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование проводили при 12°С и постоянном перемешивании до достижения опт

3.2.9. Анализ локализации гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II в клетках Е. соИ Клетки Е.соИ, трансформированные соответствующими плазмидами, выращивали в питательной среде ТВ с необходимыми антибиотиками при температуре 12°С и хорошей аэрации до достижения оптической плотности Абоо'^ЬО 0-е. Экспрессию рекомбинантных генов индуцировали добавлением ИПТГ, после чего клетки культивировали при температуре 12°С и хорошей аэрации в течение ночи. Приготовление образцов для электрофоретическог

Клетки E.coli штамма BL21 трансформировали рекомбинантным вектором pGEMEX-1/pR/NT и рассевали на чашки Петри с LB-агаром и ампицилином. Колонии с чашки инокулировали в минимальной среде М9, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование проводили при 28°С с умеренным перемешиванием в течение ночи. Затем клеточную культуру осаждали, клеточный осадок ресуспендировали в свежей среде М9, разводили до оптической плотности примерно

0.5 и индуцировали транскрипцию гена NT повышением темп

3.2.13. Анализ локализации секретируемых иейротоксинов в клетках Е. соИ Юпетки E.coli, трансформированные соответствующими плазмидами, выращивали на минимальной среде М9 с необходимыми антибиотиками при температуре 28°С и хорошей аэрации в течение ночи. Экспрессию рекомбинантных генов индуцировали повышением температуры культивирования, после чего клетки культивировали при температуре 37°С и хорошей аэрации в течение двух суток. Приготовление образцов для электрофоретического анализа в SDSПАА

Клеточную культуру центрифугировали 45 минут при 4250 об/мин и 4°С. Подводили рН культуральной жидкости до

4.5, прогревали на водяной бане при 70°С в течение 20-25 минут и снова центрифугировали 45 минут при 4250 об/мин и 4°С. Далее супернатант отбирали, разбавляли в 2-3 раза водой Milli-Q, подводили рН до

5.0 и наносили на ионообменную смолу SPSepharose (Amersham Pharmacia, Швеция), уравновешенную ЮмМ CHsCOONa рН

5.0. Элюцию проводили линейным градиентом

0.0-1.ОМ NaCl

3.2.

15.1. Электрофоретический анализ белков в SDS-IIAAr Все этапы выделения и очистки белков контролировали с помощью электрофореза в 10-13% ПААГ по Лэммли / 1 5 5 / и в 12% ПААГ в трис/трициновой буферной системе по Шегеру /156/ в присутствии

0.1 % SDS. Электрофорез белков проводили при постоянном напряжении 120 V на источнике постоянного тока Б5-50 (Россия). После проведения электрофореза гель фиксировали в растворе 10% уксусной кислоты в течение 15 мин, затем обрабатывали окрашивющим рас

Концентрации гибридных белков, а также целевых, имеющих в составе аминокислотной последовательности ароматические а.о., определяли по поглощению при длине волны 280 нм с учетом соответствующего расчетного молярного коэффициента поглощения.

3.2.

15.3. Определение Л/-концевой последовательности полипептидов Анализ Л/-концевых аминокислотных последовательностей (секвенирование) полученных белков проводили путем автоматической деградацией по Эдману с использованием газофазного секвен