Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Исследование свойств рекомбинантных модульных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторов : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02, 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71506

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

4.13. Внутриклеточиая локализация МРТ

4.14. Эффективность фотодинамического действия ФС 5. Обсуждение результатов

5.1. Сигнал ядерной локализации

5.2. Лиганд

5.3. Эндосомолитический модуль

5.4. Внутриклеточная локализация МРТ

5.5. Эффективность фотодинамического действия ФС 6.

Заключение 7. Выводы 8. Список литературы 82 82 85 85 86 89 94 96 97 98 99 101 102 106 108 112 113 117 117 120 123 125 125 127 128 129 Список сокращений аМСГ - а-мсланоцит-стиму

Протекание деетруктивных реакций в белках, липидах и нуклеиновых киелотах под действием евета при участии фотосенеибилизаторов (ФС) и кислорода лежит в основе быстро развивающегося метода лечения злокачественных в новообразований фотодинамической терании (ФДТ), заключающегося уничтожении клеток онухоли после облучения её светом, поглопщемым ФС, который накопился в этой опухоли. Перенос энергии от молекулы ФС, перешедшей под действием света в возбужденное триплетное состояние, нриводит к

2.1. Фотодинамическая тераиия в настоящее время все большее распространение в клинической онкологии находят новые методы диагностики и лечения онухолевых заболеваний, основанные на современных достижениях фотохимии, фотобиологии и квантовой физики. Одним из таких перснективных подходов является фотодинамическая терапия современный метод лечения рака, заключающегося в уничтожении IOICTOK опухоли иослс облучения её светом, гюглонщсмым ФС, который наконился в этой онухоли. При этом происходит об

2.1.1. Физико-химические евойства ФС Молекулы ФС почти всегда находятся в основном синглетном состоянии ( S ), в отсутствие фотоактивации электроны вненигего электронного уровня снарены. При поглощепии фотона, молекула ФС нереходит в короткоживущее (1 100

не) возбуждеиное синглетное состояние ('S*) без изменения электронного спина. Из этого состояния молекула может перейти в осповное состояние ('S*^) или в возбужденное триплетпое состояние ( S*) с неснаренпыми электроппыми спинами, хара

2.1.3. Методы доставки ФС в опухолевые ткани и клетки Наиболее сун1ественным недостатком ФДТ, свойственным большинству хнмиотерапевтических методов, является невысокая специфичность наконления ФС в раковых клетках. ФС, введенный в кровь, разносится но всему организму и поглопщется как опухолевыми, так и здоровыми клетками. Концентрация ФС, ноглон1енного раковыми 1О1етками, как правило, незначительно превышает таковую в нормальных клетках; это нриводит к тому, что сеанс ФДТ снособен оказать но

2.2. Направленная внутриклеточная доставка ФС в ядра онухолевых клеток-мнтеней На основании вышеперечисленных сведений можно сформулировать несколько принципиальных выводов относительно тех свойств, которыми должна обладать эффективная еистема для элиминации раковых клеток:

1) Обеспечение клеточной специфичность фотодинамического действия, что способствует мииимизации исгативных побочных эффектов ФДТ,

2) Доставка ФС внутрь онухолевых клеток, что позволяет значительно новысить эффе

2.2.1. Рецептор-опосредованный эндоцптоз Клеточная поверхность - чрезвычайно динамичная структура, участвуюнщя, наряду с внутриклеточными органеллами, в нроцессах мембранного транснорта, одной из разновидностей которого является эпдоцитоз - поглощение внеклеточной жндкости и частиц в составе мембранных опосредованного связываются эндоцитоза (РОЭ) пузырьков. В случае рецептормакромолекулы (лигандгл) внеклеточные с находящимися на плазматической мембране специфическими рецепторами, после ч

2.2.2. Цитоплазмено-ядсрный транспорт

2.2.

2.1. Сигналы внутриклеточной локализации Интернализация клеткой-мишенью лиганда или молекулярной конструкции, включающей его в свой состав, является необходимым, но не достаточным условием для эффективного поражения клетки. Это объясняется тем, что локализация лиганда после его рецептор-опосредованного поглощения клетками определяется тшюм лиганда и не обязательно может совпадать с местами в клетке, наиболее чувствительными к фотодинамич

2.2.3. Траислокационный домен дифтерийного токеина: нреодоление эндоеомного барьера

2.2.

3.1. Снособы проникновения макромолекул через лииидную мембрану При использовании рецептор-опосредоваппого эндоцптоза для адресной доставки молекул в ядра клеток-мишеней возникает существешюе препятствие, которое псходпо заложепо в механизме эпдоцитоза: гюсле иоглощеиия лигандов они (и, соответствепно, адреспые конструкции с лигапдами) оказываются в замкнутых 46 мембранных образованиях - эндос

2.2.4. Использование носителей Эффективность выполнения своих функций каждым нз пептиднглх модулей, входящих в состав нсрсносящей конструкции, в нервую очередь определяется нативиостью их первичиой структуры и конформации. Присоедииеиие ФС к любому из фyнкцlюнaJHJHыx блоков может отрицательно сказаться на конформации модуля. a значит, и на его функциональной активности. Для предотвращения подобных модификаций в систему доставки ФС можно вводить дополнительный комнонент носитель, к которому

3.1. МРТ

3.1.1. Структура и состав МРТ Исследованные в работе белки включали эпидермального интернализуемыми дифтерийного замкнутых больщого фактора роста человека рецепторами; обеспечивающего в себя последовательности связывающегося с (ЭФР), клеточными (ДТокс), транслокационного выход домена нз токсина транспортеров внутриклеточных Т-антигена вируса компартментов; SV-40 (СЯЛ сигнала SV40), а ядерной также локализации бактериального для гемоглобиноподобпого белка (НМР), служащего следу

3.1.2. Плазмиды, кодирующие МРТ Конструирование плазмид, кодирующих клеток щтамма M15(REP4) Е. соИ МРТ, а также трансформация плазмидами было соответствуюнщми осуществлено под руководством В.Г. Лупииа (лаборатория молекулярной генегнки внутриклеточного транспорта ИБГ РАИ н ВИИИСБ PACX1I). Трансформированные клетки, замороженные в присутствии 10% глицерина, хранили нри температуре -70 °С. Иа рис. 11 приведена рестриктная карта плазмиды, кодирующей один из Эпдосолш.И1ПП1К Носитель СЯЛ спей

3.1.3. Экспрессия МРТ в бактериальных клетках Рутинные пронедуры экспрессии рекомбинантных нолипептидов в бактериальных клетках проводили в соответствии со стандартными методиками (Маниатис и др., 1984). Ночную культуру клеток, трансформированных соответствующими плазмидами, разбавляли в 100 раз средой dYT («double Yeast Tryton», 5 г/л NaCl («Sigma», США), 10 г/л дрожжевого экстракта («Difco», США), 16 г/л пептона («Difco»), рН 7,5), содержащей 50 мкг/мл амниниллина и 50 мкг/мл канамицина,

3.1.4. Выделение и очистка МРТ Полученную биомассу лизировали на льду в буфере, содержащем 50 мМ фосфат иатрия («Sigma») рН 8,0, 300 мМ NaCl, 0,5% Тритон Х-100 («Serva», Германия), 1 мг/мл лизоцим («Sigma»), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ, «Sigma»), 1,5 мкг/мл анротинин («Sigma»), обрабатывали ультразвуком 40 кГц, 90 Вт («Finnsonik W-181-T», «Сои ultrasonic», Финляндия) нри температуре О °С и цешрифугировали в течение 25 минут нри темиературе 4 °С (45000xg, цеитрифуга «Beckman J2-HS»).

3.1.5. Рефолдипг лигаидпого модуля MPT Для увеличения сродства эпидермальпого фактора роста в составе МРТ к клеточному рецептору был проведеп рефолдипг данного модуля в нрисутствии окисленного и восстановленного глутатиопа. МРТ (конечная концентрация 10 мкМ) инкубировали на льду в буфере, содержащем 10 мМ фосфат натрия рЫ 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА, «Sigma»), 0,5 мМ ФМСФ, 2 мМ окисленного глутатиона («Sigma»), 0,67 мМ восстановленного глутатиона («Sigma»

3.2. Получение импортинов Для проверки фупкциональной активности сигнала ядерной локализации в составе МРТ были выделены и очищены комионенты белкового комплекса, опосредующего транспорт через ядерную пору, РТАС97 (р-импортин) и РТАС58 (а-импортин), комплекс которых, как было показано Имамото с коллегами (Imamoto et al., 1995b), осуществляет ядерный импорт СЯЛ больпюго Т-антигена вируса SV-40, который входит в состав исследованных МРТ.

3.2.1 Плазмида, кодирующая Р-имиортии Плазмида pGEX2T-HA-PTAC97 с опероном, экспрессирующпм химерпый белок (глyтaтиoп-S-тpaпcфepaзa)-PTAC97 (Р-импортии), была любезно 59 предоставлена доктором И. Ионеда (Университет Осаки, Япония). Рестриктная карта плазмиды приведена на рис. 12. EcoMI P-lacW Swal Aoull BamHI Nhel Ecu 36 Sad , Xmalll ^g^z^Z'-^^- -BseRI tie ^'^^^Sv ^ 4 / 4 . Kasi . V • Ehel ;0 Hpal -;' BsoHII - Iacl . \ / Narl ,, / - p-lac lacZ' X \\ ==:=^Г"^чХ,-'- Muni CiST B

3.2.2. Трансформация клеток Трансформацию клеток Е. соИ штамма BL21 плазмидой проводили методом элекгропорации. Бактериальные клетки были любезно предоставлены И.В Пальтовой (ИБГ РАН). Ночную культуру клеток разбавляли в 50 раз средой dYT и растили при температуре 37 °С в течение 3 - 4 часов при покачивании. После достижения мутности суспепзии значения равното 0,9- 1,0 относительных единиц (?i=600

нм) клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут при температуре 4 °С (9500xg, ц

3.2.3. Клетки, экспрессирующие а-импортин Клетки Е. coli штамма JM109 с плазмидой pQE-IA (рис. 13), полученной па оспове коммерческого вектора pQE60 («QIAGEN») и содержащая в своем составе геп РТАС58, были любезно предоставлепы в.п.с. В.Л. Друцей (лаборатория молекулярной генетики внутриклеточного транснорта ИБГ РАИ н ПИИ ФХБ им. А.П. Белозерского МГУ). Рекомбинантный а-импортип содержал 6-гистиди1ювую последовательпость па С-копце для аффиппого выделения на Ni-NTA-агарозе.

3.2.4. Экспрессия импортииов в бактериальиых клетках Ночную культуру клеток разбавляли в 50 раз средой dYT и растили при температуре 37 °С в течепие 3 - 4 часов при покачивании. После достижения мутности суснензии значения равного 0,9-1,0 относительных единиц поглон1епия при 600 им, темнературу суснензии и окружающей среды снижали до 20 °С и индуцировали экспрессию импортинов с помощью ИПТГ в копцептрацни 1 мМ. Bsa'M Fspl Asel Ч Eam1105 Л 'Ыа iJ Seal Px-ul BseRI BsmI EcoRI PwUll AtiVNI Mu

3.2.5. Выделение и очистка а-имиортииа Очистку а-импортина проводили с помощью аффинной колоночной хроматографии на Ni-NTA-агарозе при температуре 4 °С. Супернатант наносили на колонку длиной 1 см, диаметром 1 см со скоростью 25 мл/час, затем 62 последовательно промывали 5 объемами буфера, содержащего 50 мМ фосфат натрия рН 8,0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1% глицерин, 0,5% Тритон Х-100, и 50 объемами буфера, содержащего 50 мМ фосфат натрия рИ 8,0, 300 мМ NaCl со скоростью 25 мл/час. Элюцию

3.2.6. Выделение и очистка Р-имиортииа Выделение химерного белка проводили методом аффинной колоночной хроматографии на глутатнон-Сефарозе 4В («Pharmacia Biotech», Швеция). На колонку диаметром 1 см, длиной 1 см наносили клеточный лизат со скоростью 15 мл/час, промывали колонку буфером, содержащим 140 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1 («Serva»), 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ КН2РО4 («Sigma»), рН 7,6 для смыва белка, неспсцнфически связанного с колонкой. Элюцию снецифически связанного белка проводили согласно инстр

3.3. Измерение концентрации белка Белок с концентрацией в дианазоне от 100 до 1000 мкг/мл смещнвали с реактивом Бредфорда (0,01% Кумасси G-250 («Serva»), 5% этиловый сгнфт («Merck»), 8,5% ортофосфорная кислота («Химмед», Россия)) в соотношении 1:20 (Досон и др., 1991). Через 5-10 минут измеряли оптическую нлотиость раствора нри длине волны 595 нм на спектрофотометре «Multiscan EX» («Labsystem», Швеция). Концентрацию белка онределяли но предварительио построенной калибровочной кривой зависимо

3.4. Электрофорез белков Электрофоретическое разделение белков по молекулярным маееам проводили с помощью депатурирующего электрофореза в нолиакриламидном геле но Леммли в стандартных условиях (Pharmacia, 1990) в камере для вертикального электрофореза («Хеликон», Россия). Пробы белка смещивали с буфером для нанесения (0,02 М Трис-НС1 («Serva») рМ 8,0 0,002 М ЭДТА, 2% ДДС-Na, 10% рмеркантоэтанол («Serva»), 20% глицерин, 0,002% бромфеноловый синий («Sigma»)) в соотнощении 1:1 и кипятили на водя

3.5. Вестерп-блот препаратов МРТ Пренараты МРТ после электрофоретического разделения в нолиакриламидном геле (см. пункт

3.4) переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond^ECL"^^ («Amersham Biosciences», Великобритания) путем полусухого пере1юса в буфере, содержан1ем 25 мМ Трис-НС1, 192 мМ глицип рН 8,3, 20% этиловый спирт, 0,1% ДДС-Na, в течеиие 30 минут, сила тока 2 мА/см^. Для предотвран1спия неснсцифического связывания и подготовки к гибридизации с антителами мембрану инкубиро

3.7. Фотосепсибилизатор в работе был исиользован фотосенсибилизатор хлорин е^ («Porphyrin Products Inc.», США). Формула фотосенсибилизатора приведена на рис. 14. с :нз СНз \ . NH 1 N= N HN— НзС \ ; \ СООН СООН СООН Рис. 14. Структура использованного в работе ФС хлорина

3.7.1. Получение водного раствора тринатриевой соли хлорина ^б Все онерации с хлорином нроводились в темноте в атмосфере ииертного газа. 1 мг хлорина бб растворяли в 100 мкл 0,1 М раствора NaOH («Merck», Германия) в метиловом спирте («Sigma») в молярпом соотьюшенни 66 хлорин : NaOII = 1 : 6 и инкубировали в течение 1 часа ири комнатной температуре при постояином иптенеивном перемешивании. Получетшш раствор хлорина центрифугировали в течение 10 минут на центрифуге «Jouan MR 1812» («Jouan», Фр

3.8. Синтез и очистка коиъюгатов МРТ с ФС Все операции с ФС проводили в темноте в атмосфере ипертного газа. Все растворы перед использованием цецтрифугировали в течение 10 минут на центрифуге «Jouan MR 1812» (16500xg).

3.8.1 Активация карбоксильных груии хлорина ^б К буферу для активации карбоксильных групп ФС, содержаи1ему 10 мМ MES («Sigma») рН 6,5, 1 мМ ДДС-Na, добавляли 3 мМ водный раствор хлорина е^ Д О конечной концентрации последпсго 150 мкМ. Получеппый раствор смешивали со свежеприготовленными сшиваюшего агента водными растворами бифункционального кросс(0,1 М; 1-этил-3-(3-диметиламииопропил)-карбодиимида «Sigma») и N-гидроксисукцинимида (0,1 М; «Sigma») в молярном соотношении ФС : карбодиимид : N-

3.8.3. Очистка конъюгата Для очистки конъюгата от ненрисоединенного ФС и сшиваюнщх агентов использовали метод гель-фильтрации (Sephadex G-50, «Pharmacia», Швеция). Реакционную смесь после окопчания инкубации с гидроксиламином подшелачивали добавлением 1 М NaOII до значения рН 9,0, затем добавляли 250 мМ раствор ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и сухой гуаиидии-гидрохлорид («Sigma») до конечной концентрации 3 М. После инкубации на льду в течение 30 минут при поетоянном перемешивапии осаждал

3.9. Культура клеток Клетки энидермоидной карциномы человека линии А431 культивировали в среде DMEM {Dulbecco Modified Eagle's Medium, «Sigma») с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки («Gibco», США) и 50 мкг/мл гентамицина («Дальхимфарм», Россия) при 5% СОг и 37 °С в СОг-инкубаторе «EG 115 IR» («Jouan», Франция).

3.10. Определение количества рецепторов к ЭФР и МРТ па поверхпости клеток А431 п копстапт сродства радиоактпвпо мечеппых ЭФР п МРТ к рецепторам Клетки линии А431 рассев