Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71500

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

3.6.4. Дефосфорилирование 5'-концов ДНК с помощью щелочной фосфатазы М. ruber

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 74 76 77 79 85 87 с п и с о к ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ИПТГ 4НФФ ПЛАГ ПЦР ЭДТА п.н. т.п.н. BCIP CIAP изопропил-1 -тио-Р-В-галактопиранозид 4-нитрофенилфосфат полиакриламидный гель полимеразная цепная реакция этилендиаминтетрауксусная кислота пар нуклеотидов тысяч пар нуклеотидов 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат щелочная фосфатаза из кишечника теленка (calf intestine alkaline p

1.1. Щелочная фосфатаза микроорганизмов и высших организмов

Щелочная фосфатаза - широко распространенный в природе фермент. Она обнаружена в дрожжах, микроорганизмах, грибах, низших растениях, в тканях млекопитающих, лимфе, плазме, лейкоцитах крови, молоке и т. д. (Мецлер, 1981). В животных организмах этот фермент встречается почти во всех органах. Сравнительно высока его концентрация в печени, тонком кишечнике, костях, почках, селезенке и желчных капиллярах (Вилкинсон, 1981). По данным некоторых авторов щелочная фосфатаза находится в свободном виде в

Из всех выделенных в настоящее время щелочных фосфатаз наиболее изученной является щелочная фосфатаза из Е. соИ. Мономер синтезируется в виде одной полипептидной цепи с относительно гидрофобным N-концом сигнальным пептидом. Последний включается в секреторный процесс и отщепляется сигнальной пептидазой, прикрепленной к внешней поверхности внутренней мембраны. Щелочная фосфатаза Е. coli представляет собой гомодимер с молекулярной массой 94 000 Да. Каждая субъединица состоит из 449 аминокислотны

Каталитический механизм щелочной фосфатазы описывается схемой 1 (Кут and Wyckoff, 1991): Н2О RLOH V . ^ ^ ^ E-Pi ::^=*:E + Pi E + R , O P : ^ = ^ E - R i O P : ^ : ^ E-P ^ ^ ^ / " ^ ^ R2OH Схема 1. В принципе, эти реакции гидролиза можно рассматривать как частный случай трансферазных реакций, в которых происходит перенос части молекулы субстрата на гидроксильную группу воды. Этим объясняется способность щелочной фосфатазы катализировать фосфотрансферазную реакцию, при которой освобожда

Субстратная специфичность. Щелочная фосфатаза является ферментом с очень широкой субстратной специфичностью, несколько различающейся в зависимости от источника выделения. Ее субстратами являются различные 15 моноэфиры ортофосфорной кислоты (ROP), как алифатические (глицеро-1фосфат, глицеро-2-фосфат), так и ароматические (4-нитрофенилфосфат), а также содержащие подобную фосфоэфирную связь углеводы, нуклеотиды и белки (Спиро, 1978). Химическая природа и размеры радикала R не имеют значения, так

1.1.5. Механизм регуляции экспрессии (на примере Е. соЩ Е. соИ обладает сложным механизмом регуляции поглощения и метаболизма фосфата (Pi), включающим фосфатный регулон, схема регуляции которого, предложенная Rao et al (1986), представлена на схеме 2. Регулон состоит из 20-30 генов, все они индуцируются продуктом гена phoB и репрессируются присутствием Pi в среде роста. Ген phoA кодирует щелочную фосфатазу, которая расщепляет органические фосфомоноэфиры с освобождением Pi. Гены-сенсоры уровня

Выяснение возможных границ существования живых организмов является одной из важнейших проблем современной биологии. Известен ряд растений, животных и микроорганизмов, живущих в необычных условиях, называемых экстремальными. К экстремальным условиям существования относятся высокие и низкие температуры, крайние значения кислотности среды, высокие концентрации солей, повышенное давление, высокая интенсивность облучения, крайне бедные по химическому составу питательные среды и высокие концентраци

На сегодняшний день вьщелены и частично охарактеризованы термостабильные щелочные фосфатазы из следующих термофильных бактерий: Thermus aquaticus (Yeh and Trela, 1976), Т. caldophilus (Kim et al., 1997), T. sp. (Ji et al., 2001) T. thermophilus (Pantazaki et al., 1998), Thermotoga neapolitana (Dong and Zeikus, 1997), и В. stearothermophilus (Mori et al., 1999). В свою очередь, гены щелочных фосфатаз термофильных бактерий Т. sp. (Yuan et al., 1998), Т. caldophilus (Park et al., 1999) и гиперте

Иммуноферментный анализ, основанный на использовании твердофазных носителей (ELISA), является одним из наиболее быстрых и чувствительных методов качественного и количественного определения содержания антигенов или антител в образцах (Иммуноферментный анализ, 1988). В настоящее время ELISA применяют для определения содержания в кровотоке антител против бактериальных антигенов, вирусных антигенов и антител к ним, а также антител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (Глик и Пастернак, 200

Щелочная фосфатаза широко используется в молекулярной биологии для дефосфорилирования 5'-концов нуклеиновых кислот при конструировании рекомбинантных плазмид (Sambrook et al., 1989). Обработанные таким образом линеаризованные плазмиды не способны лигироваться сами на себя, что облегчает вставку в них чужеродной ДНК. Щелочная фосфатаза находит применение в нерадиоактивных методах детекции (Глик и Пастернак, 2002). В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченые каким-либо

В живых системах непосредственное наблюдение за каким-либо процессом часто может быть затруднено из-за многих факторов. Одним из современных подходов к решению этой задачи является применение репортерного гена, в качестве которого наряду с другими может быть использован ген щелочной фосфатазы. Репортерный ген может быть применен для оценки экспрессии генов. В этом случае транскрипцией репортерного гена управляет представляющий интерес промотор, а энзиматическая или биологическая активность ре

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ И С С Л Е Д О В А Н И Я

2.1. Культивирование штаммов микроорганизмов В работе были использованы штаммы М. ruber 132-4К и М. ruber 40 из коллекции Института микробиологии РАН. Клетки выращивали при 56°С до поздней экспоненциальной фазы на качалке в колбах со средой, содержавшей 10% картофельный экстракт, 0,5% пептон, 0,2% дрожжевой экстракт, рН 8,0. Штамм Е. соН В из коллекции Института молекулярной генетики РАН использовали для получения геномной ДНК. Клетки выращивали при ЗТ^С до поздней экспоненциальной фазы на ка

2.2. Клонирование фрагмента гена щелочной фосфатазы ruber М Выделение геномной ДНК М. ruber и Е. соИ проводили, как описано ранее (Marmur, 1961). Генно-инженерные манипуляции проводили в соответствии с Sambrooke^a/. (1989). Амплификацию фрагментов геномной ДНК М. ruber и Е. соИ, содержавших часть гена щелочной фосфатазы, проводили в реакционной среде следующего состава (конечный объем 30 мкл): 10 мМ Трис-НС1 буфер, рН 8,8, 50 мМ КС1, 0,5% Твин-20, 5% формамид, каждый из четырех дезоксинукле

^^Р-радиоактивно меченый зонд получали методом случайной затравки с использованием £со521-фрагмента плазмиды pMrul, содержавшего клонированный участок гена щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К. Геномную ДНК М. ruber и Е. coli расщепляли рестриктазами ВатШ, Hindlll и Pstl. Разделение рестрикционных фрагментов проводили в 0,7% агарозе. Перенос ДНК на мембрану Nytran Plus (Schleicher & Schuell, США) осуществляли капиллярным методом в щелочных условиях в течение ночи. Мембрану запекали при 80°С

2.4. Конструирование плазмид для экспрессии гена щелочной фосфатазы М. ruber в клетках Е. соИ Для экспрессии гена щелочной фосфатазы М. ruber в клетках Е. соИ BL21(DE3), содержащих хромосомную копию РНК-полимеразы фага Т7 под контролем /acUV5 промотора, было сконструировано несколько плазмид. Для получения плазмиды pMruAP2, содержащей полноразмерный ген, кодирующий предшественник щелочной фосфатазы вместе с сигнальным пептидом, NcolBglll фрагмент pMruAPl клонировали по Ncol-ВатШ сайтам плазми

Ночные культуры клеток Е. соИ BL21(DE3), трансформированных рекомбинантными плазмидами pMruAP2, pMruAP2a, pMruAP2b, pMruAP2c или векторами pET-22b, рЕТ-28а, а также ночную культуру клеток Е. coli НВ101, трансформированных рекомбинантной плазмидой pMruAP2d или вектором pGEX-2T, разводили в 50 раз в свежей среде и растили до достижения оптической плотности 0,6-0,8 при 600 нм. Культуры индуцировали добавлением ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали еще 3 ч. Аналогичным образом выращив

Реакционную смесь (конечный объем 1 мл), содержащую 5 мМ 4НФФ, 100 мМ глицин-NaOH буфер, рН 11,0, 2 мМ MgCb и 0,1 мл разведенного соответствующим образом препарата щелочной фосфатазы, инкубировали при 60°С. Реакцию останавливали, добавляя 42 мкл ЮМ NaOH. Степень гидролиза 4НФФ определяли спектрофотометрически при 410 нм по поглощению освобождающегося 4-нитрофенола. Для исключения вклада неферментативного гидролиза использовали контроль, не содержавший раствора фермента. За единицу активности

2.7. Определение оптимума рН и температуры и термостабильности щелочной фосфатазы М. ruber Для определения оптимума рН проводили измерения активности фермента при разных значениях рН и прочих стандартных условиях. Использовали 100 мМ Трис-НС1 буфер в интервале рН 7,5-9,0 и 100 мМ глицин-NaOH буфер в интервале рН 9,5-12,5. Для определения оптимума температуры стандартную реакционную смесь инкубировали при различных температурах. При изучении температурной стабильности щелочной фосфатазы раств

Для изучения влияния ионов металлов на активность щелочной фосфатазы активность фермента измеряли в присутствии различных ионов металлов в концентрации 2 мМ, в качестве противоиона использовали хлорид. При определении влияния химических агентов на активность щелочной фосфатазы активность фермента измеряли в присутствии определенного соединения в различных концентрациях при прочих равных условиях.

2.9. Определение Определяли субстратной специфичности щелочной щелочной фосфатазы с ф

Для получения полноразмерного гена были клонированы фрагменты гена щелочной фосфатазы, чтобы затем использовать их в качестве зонда. Фрагменты были получены с помощью ПЦР. Для дизайна праймеров были использованы данные GenBank Nucleotide Sequence Databases и пакет программ BioEdit (Hall, 1999). Были сравнены аминокислотные последовательности пяти бактериальных щелочных фосфатаз из Е. соИ, Е. fergusonii, В. subtilis, Т. maritima и Т. sp. (рис. 7). Последовательность щелочной фосфатазы Т. s

ПЦР-фрагмент, полученный на геномной ДНК М ruber 132-4К, был использован в качестве зонда при Саузерн-гибридизации с препаратами геномной ДНК М. ruber 132-4К, М ruber 40 и Е. соН, обработанными тремя различными рестриктазами (рис. 9). Во всех случаях четкий гибридизационный сигнал был связан с единственным рестрикционным фрагментом. В выбранных нами жестких условиях гибридизации с геномной ДНК Е. соИ не наблюдалось. Как видно из рис. 9, наиболее сильные сигналы были обнаружены в случае гибрид

3.2. Нуклеотидная последовательность гена щелочной фосфатазы М. ruber Нуклеотидная последовательность клонированного гена щелочной фосфатазы М. ruber и соответствующая ей предсказанная аминокислотная последовательность, представленные на рис. 11, были депонированы в банке данных GenBank (Асе. No AY157731). В нуклеотидной последовательности имеется открытая рамка считывания длиной 1509 п.н., кодирующая полипептид из 503 аминокислотных остатков, рассчитанный молекулярный вес которого сост

3.4. Биосинтез рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber в клетках Е. соИ Результаты экспериментов по экспрессии гена щелочной фосфатазы М. ruber в клетках Е. соИ суммированы в табл. 6. При культивировании клеток Е. соИ BL21(DE3), содержащих рекомбинантную плазмиду pMruAP2 с геном предшественника щелочной фосфатазы М. ruber под контролем сильного промотора фага Т7, наблюдалась сверхэкспрессия гена, в результате чего рекомбинантный белок составлял более 50% от общего белка клетки. Однако почт

3.5. Выделение и очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber Разработанная схема очистки рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber из клеток Е. соИ НВ101, трансформированных плазмидой рМгиЛРЗ, основана на комбинации методов, наиболее часто используемых при вьщелении термостабильных щелочных фосфатаз, как нативных, так и рекомбинантных (Dong and Zeikus, 1997; Kim et al, 1997; Mori et al, 1999; Zappa et al, 2001). Предлагаемая схема включает прогрев с целью денатурации посторонних белко

Предварительно нами была проведена характеризация рекомбинантного фермента, используя грубый лизат, полученный при культивировании клеток Е. соИ BL21(DE3), несущих плазмиду рМгиАР2 (Yurchenko et al, 2003; Юрченко и соавт., 2003). Это было возможно благодаря тому, что в супернатанте после отделения телец включения оставалась значительная активность рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber (0,5 Ед на мг общего белка), которая более чем в 20 раз была выше активности собственной щелочной

Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизированные ферменты. / Под ред. Березина И.В., Мартинека К.М.: Изд-во МГУ, 1982, С. 343-352. 5. Егорова Л.А., Логинова Л.Г. (1984). Отбор культуры, образующей щелочную 6. фосфатазу у термофильных бактерий рода Thermus. Микробиология. Т. 53, вып. 2, 242-245. Зуева Н.Н., Далев П.Г., Лазарова Д.Л. (1993). Свойства, получение и практическое применение щелочной фосфатазы. Биохимия. Т.58, вып. 7, 1009-1023. 7. 8. Квеситадзе Г.И. // Ферменты микроорганизмов