Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Сравнительный анализ геномов бактерий видов Burkholderia pseudomallei и B. mallei методом вычитающей гибридизации : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71495

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Введение 1. Выбор экспериментальных объектов 2. Вычитающая гибридизация 3. Библиотека фрагментов ДНК, отличающих геном В. pseudomallei САЛ^ от В. mallei С-Ъ 2 27 27 29 30 31 32 34 35 36 37 38 38 40 40 42 43 46 47 47 48 49 52

3.1. Сравнительный анализ с последовательностями, депонированными в базах данных

3.2. Функции генов, представленных дифференциальными последовательностями ДНК

3.2.1 Мобильные элементы и гены бактериофагов

3.2.2 Регуляторы транскрипционной активност

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Материалы

1.1 Оборудование

1.2. Буферы, солевые растворы

1.3. Химические реактивы

1.4. Готовые наборы реактивов

1.5. Препараты, меченые радиоактивными изотопами

1.6. Ферменты

1.7. Олигонуклеотиды

1.8. Микробиологические среды

1.9. Антибиотики

1.10. Компетентные бактерии

1.11. Препараты геномных ДНК 3 99 102 106 106 106 106 108 109 109 109 109 109 110 111 111 81 85 2. Методы

2.1

Введение Мелиоидоз представляет собой опасное заболевание человека и животных, которое наиболее широко распространено в странах юго-восточной Азии [286]. В настоящее время мелиоидоз признан одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения таких стран, как Австралия и Таиланд, что обусловлено высокой смертностью от этого заболевания даже при условии своевременной антибиотикотерапии [286]. Являясь экзотичной инфекцией в других частях мира, мелиоидоз, тем не менее, обладает неограничен

в 1992 г. на основании сходства между 16S рРНК генами несколько видов бактерий рода Pseudomonas были объединены в новый род Burkholderia [300]. С того времени классификация рода Burkholderia претерпела существенные изменения. Некоторые виды, например, Burkholderia pickettii и В. solanacerum, были реклассифицированы в новый род Ralstonia (Рис.

2) [301]. Таксономический анализ другого вида Burkholderia, В. cepacia, выявил по крайней мере пять групп микроорганизмов, различающихся особеннос

В. pseudomallei, грамотрицательные подвижные бациллы, являются почвенными сапрофитами, населяющими ризосферу и водные резервуары северо-восточного Таиланда, северной Австралии и других областей земного шара с тропическим и субтропическим климатом [57,58,213,233]. В естественных условиях среды обитания эти микроорганизмы способны существовать в двух формах, находящихся в динамичном равновесии друг с другом: в свободно-живущей форме и в форме биопленки [281]. На настоящий момент не известно, к

2.3. Краткая характеристика молекулярных основ патогенеза при мелиоидозе Мелиоидозная инфекция описана у многих видов животных: крыс, мышевидных грызунов, кроликов, коров, собак, кошек, кенгуру [58]. Животные-носители выделяют возбудителя с мочой и испражнениями, заражая при этом новые территории. Заражение человека может наступать при употреблении инфицированной пищи или воды, а также воздушно-пылевым путем [58]. Часто инфицирование наступает при загрязнении мелких повреждений кожи почвой [2

2.4. Популяционное разнообразие В. pseudomallei Высокое генетическое разнообразие представителей вида В. pseudomallei сильно затрудняет выявление отдельных популяций и делает чрезвычайно затруднительным определение времени их независимой эволюции. Наиболее полно популяционное разнообразие вида В. pseudomallei изучено методом риботипирования [276]. На настоящий день известно 44 риботипа В. pseudomallei [216]. 19 из них представлены единичными штаммами бактерий. Доминирующими являются риботипы

2.5. Особенности организации генетического аппарата В. pseudomallei в сравнении с В. mallei Геном В. pseudomallei состоит из двух кольцевых репликонов размером 4,07 миллионов пар оснований (мпо) и 3,17 мпо, получивших название хромосом 1 и 2 соответственно (Рис. 5). Общая характеристика репликонов представлена в таблице 1 на примере хромосом штамма В. pseudomallei К96243. Детальная характеристика генома этого штамма приведена в [119]. Таблица 1. Общая характеристика хромосом В. pseudomallei ш

2.6. Факторы вирулентности в. pseudomallei

Как уже отмечалось, В. pseudomallei являются факультативными патогенами и способны к внутриклеточному паразитизму в клетках эпителиального типа, фибробластах и в профессиональных фагоцитах человека и животных. В. pseudomallei устойчивы ко многим специфическим и врожденным неспецифическим защитным системам иммунитета хозяйского организма. Механизмы, позволяющие В. pseudomallei избегать действия бактерицидных факторов внутри зараженного организма-хозяина, изучены недостаточно хорошо. Известно,

Центральной системой многих грамотрицательных бактерий, вовлеченной в процессы инвазии и распространения внутри хозяйской клетки, является система секреции 3 типа [85,125,154]. Показано, что геном В. pseudomallei содержит три кластера генов (tts\, 2 и 3), кодирующих эффекторы системы 3 типа [119]. ttsl и 2 по организации генов в кластерах и их нуклеотидному составу схожи между собой [119,222]. Rainbow с соавт. было показано, что геномы В. mallei и В. thailandensis содержат генные кластеры, сх

В. pseudomallei способны продуцировать два вида липополисахаридов, входящих в состав клеточной стенки, которые различаются строением внешних полисахаридных цепей (0-антигенами). 0-антигены I типа представляют собой неразветвленные гомополимеры, состоящие из остатков 2-0-ацетил-6-деокси-Р-0-манногептопиранозы [176,208]. Полисахариды 2-го типа - это неразветвленные гетерополимеры со структурой /3-В-глюкопираноза-(1,3)-6-деокси-о;

-Ь-талопиранозаЯ)-глюкопираноза [73,208]. На основании схо

Уже достаточно давно известно, что В. pseudomallei способны продуцировать вещества, обладающие сильным цитопатическим эффектом на клетки в культуре и способные оказывать общее токсическое действие на зараженный организм в целом [18,29,104,113,204]. Тем не менее, в геноме В. pseudomallei не обнаружено генов, кодирующих вещества, схожие с известными токсинами грамотрицательных бактерий [119]. По данным Holden с соавт. потенциальные детерминанты вирулентности В. pseudomallei представлены генами

Ряд исследователей отмечают, что флагеллы В. pseudomallei могут являться детерминантами вирулентных свойств этих бактерий [50]. Существующие экспериментальные данные, посвященные этому вопросу, противоречивы. Так, группой исследователей во главе с Gan было показано,' что мутанты В. pseudomallei, дефицитные по продукции флагеллярного белка, неспособны вызывать инфекцию у мышей при их введении в перитонеалькую полость [162]. Однако, такие мутанты in vitro оставались способными инфицировать кле

2.6.6 Адгезины В геноме В. pseudomallei обнаружены гены адгезивных белков, например, гемаглютининов [119]. Гемагглютинины представляют собой важные бактериальные факторы вирулентности, которые необходимы для прикрепления патогенов к хозяйским клеткам-мишеням [54,165]. Одними из наиболее хорошо изученных являются гемагглютинины В. pertussis и В. bronchiseptica [79,133,136,140,165]. Гемагглютинин В. pertussis (Fha, Filamentous Hemagglutinin) представляет собой поверхностно-ассоциированный бел

3.1. Исследования серологического статуса в эндемичных по мелиоидозу регионах у подавляющего количества людей в крови циркулируют антитела к В. pseudomallei [14,59,88,192]. Считается, что 4-х кратное увеличение концентрации антител по сравнению с нормой может указывать на мелиоидозную инфекцию [14,75]. Для выявления специфических антител в сыворотке людей применяют методы непрямой гемагглютинации, иммунофлуоресценции и ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) [14,17,75,149,211,275,304]. В к

Наиболее распространенными в силу своей дешевизны и простоты являются бактериологические методы исследований. В качестве биопроб могут быть взяты соскобы ротоглоточной полости, гнойные выделения, кгровь и моча больных пациентов [284,298,309]. Я р^емс/отаЯе/являются факультативными внутриклеточными патогенами [111,137]. Поэтому некоторые исследователи рекомендуют использование препаратов биопсии красного костного мозга в дополнение к биопробам крови [60]. Целесообразность биопсии красного кост

Иммунизация лабораторных животных инактивированными бактериями позволяет получать сыворотки, содержащие поликлональные антитела к поверхностным структурам В. pseudomallei. При иммунизации антитела вырабатываются к экзополисахаридам, гликопротеинам, липополисахаридам и различным поверхностным антигенам В. pseudomallei [8,145,227,240,252,253]. Иммуногистохимические тесты с использованием поликлональных антител эффективны для детекции В. pseudomallei из биопроб гортани, гноя, мочи и бактери

Бациллы В. pseudomallei могут быть дифференцированы от других представителей Burkholderia с помощью биохимических тестов [16,63]. Для дискриминирования В. pseudomallei от представителей вида В. cepacia применяют тесты на определение активности аргинин дегидролазы (ADH), лизин декарбоксилазы (LDC), орто-нитрофенил/З-В-галактопиразинозидазы (ONPG) и тест на редукцию нитрата в нитрит (NIT) [16]. Бактерии вида В. pseudomallei ADH и NIT позитивны, но LDC и ONPG негативны, тогда как представители в

Бактериологические исследования, направленные на идентификацию В. pseudomallei, затруднены всвязи со своей продолжительностью (не менее 1 недели), а серологические методы исследований обладают невысокой чувствительностью и специфичностью, что отчасти связано с перекрестными реакциями антител на антигены филогенетически 40 близких бактерий [12,239]. Преимуществом полимеразнои цепной реакции (ПЦР) с праймерами, сконструированными по последовательностям специфических генов В. pseudomallei являют

Для увеличения чувствительности детекции возбудителя мелиоидоза на сегодняшний день разработано несколько видов комбинированных диагностических методов. Наибольшее распространение получили методы, основанные на комбинации ПЦР с иммуноферментным анализом (ИФА) и гибридизацией [150,159,260]. ПЦР-ИФА представляет собой метод, созданный специально для использования в клинических лабораториях [150]. Метод существует в двух принципиально схожих между собой модификациях [150]. В основе первого вари

Очевидно, что варианты 5. pseudomallei вызывающие мелиоидоз в разных районах земного шара могут различаются своим происхождением и генетическими особенностями. Чтобы иметь возможность ответить на вопрос, как штамм, вызвавший локальную вспышку мелиоидоза в данном регионе, соотносится с уже известными типами бактерий требуются методы молекулярного типирования, позволяющие эффективно дискриминировать разные штаммы В. pseudomallei друг от друга [215,276]. Сопоставление данных генотипирования с э

ГЛАВА П. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Как отмечалось ранее, В. pseudomallei и В. mallei являются филогенетически близкими видами грамотрицательных бактерий. Высокий полиморфизм, с одной стороны, перекрывания генных и антигенных характеристик В. pseudomallei и В. mallei, с другой стороны, ведут к серьезным проблемам в дифференциальной диагностике этих инфекционных агентов и к сильным затруднениям в идентификации факторов вирулентности. Первым шагом к решению этих задач является ан