Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Характеристика первичной структуры дивергентной области максикольцевой кинетопластной ДНК низших трипаносоматид Leptomonas seymouri и Leptomonas collosoma : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71494

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

0 Электрофорез ДНК в агарозном геле ДНК

3.12 Определение последовательности ДНК по Сэнгеру 4. Результаты и обсуждения 4 6 6 8 9 15 19 33 33 33 34 37 38 40 40 47 50 50 51 56 58 Субклеточная локализация и организация кинетопластной ДНК 3. Материалы и методы Метод long PCR в присутствии бетаина с целью получения

3.11 Клонирование рестрикционных фрагмс1ггов ДО максикольцсвой

4.1 Различия гена ND8 кпДНК консервативной между области (КО) и 58 максикольцевой Leplomonas

4. Построение рестрикционной карты максикольцевой кпДНК (^ Lcptomonas seymouri 60

4. Построение рестрикционной карты максикольцевой кпДНК Lcptomonas collosoma

4.3 67 Клонирование и секвеннрование рестрикционных фрагменнтов ДО и ПЦР-продуктов

4.3.1 Клонирование и секвеннрование 70 рестрикционных кпДИК 72 и секвеннрование рестрикционных кпДНК 86 фрагменнтов и ПЦР-продуктов ДО максикольцевой i \Ф ' Lcptomonas scymouri

4. Клонирование фрагменнтов и ПЦР-продуктов ДО максикольцевой Lcptomonas collosoma

4.4 Сравнительный анализ CSB-блоков в дивергентной области максикольцевой и в консервативной области миникольцевой кпДНК 89 92 93 5. Выводы 6. Приложение

6.1 Последовательность нуклеотидов у^шстков ДО максикольцевой кпДНК Lcptomonas scymouri и Lcptomonas collosoma 93 области

6.2 Последовательность нуклеотидов консервативной миникольцевой кпДИК Lcp. scymouri, Lcp. collosoma и других вид

Общая характеристика кинетопластной ДНК Обычно кпДНК представлена в виде сложного ассоциата, состоящего из молекул двух классов. Это миникольцевые и максикольцевые молекулы (Simpson, 1973; Kleisen et al, 1975; Muhlpfordt, 1975). Каждый ассоциат содержит примерно 20-50 максикольцевых и 5000-10000 миникольцевых молекул. Максикольцевая кпДНК в клетке транскрибируются и функционально аналогична митохондриальной ДНК других организмов (Simpson et al, 1980; Johnson et al, 1982). Такое большое количе

10 Колесников НДР,. 1984 Колесников, 1993а Cheng and Simpson 1978 Hem. (?) Makis krevis. Hem. 1065 Leptomanas coUosnma Critkidia oncopelti Blastncritliidia culicis Tryp-anosoma spp. (рыбы) 27 24,5 Маслов и др., 1982 2350, 1950, 1650, 130Q 1800 Pestov ct a l , 199Q цит, no Колссшисов, 19936 Колесников н Заннчск, 1990 Chen and Donclson 1980 Euphorbia sp. etal, Eupk; Dievches humilis, .Kisius euphorbiae, Stenocephalus agilis ct al. Hem. Cerris dissortis, G. remif;is. Hem. НСНЗЕССТНЫ Anop

Организация мпнпкольцсвых молеку'л кпДНК Мнникольца составляют основную массу ассоциата кпДНК (от 85 до 95%). Предполагается, что они ведут свое происхождение от митохондриальных плазмнд (Lukes et al., 2002). Мнникольца являются наиболее высоковариабельным компонентом кпДНК трипаносоматид. Только 10% их длины занимает консервативная область, оставшаяся часть варьирует по величине и нуклеотидиои последовательности не только меяшу видами, но и между различными штаммами одного вида (Feagin et al

Организация максикольцевых молекул кпДНК Максикольца гомологичны митохондриальному геному других групп и, как полагают (Колесников, 1993), гомогенны по последовательности в одном кинетопласте. Максикольца состоят из двух областей - консервативной и вариабельной (дивергентной) (Рис. 6). Leptomonas coUosoma з 26kb ^ со ,^- J-^ Рис. 6 Консервативная область и дивергентная область максикольцевой кпДНК на примере Lep. collosoma ?n Консервативная область содержит плотно сгруппированные гены м

Ферменты и реактивы 5г Юг 15

г) > В работе были использованы следующие ферменты и реактивы: • Спещ1фические рестрикционные эндонуклеазы EcoAl\,Msp\, PvuW, ЕсоШ, Bgni, ВатШ, EcolOSl, Xbal, XIiol, ВсП, Sau3Al, BsulSRl (Clal), Mhil, Hindlll, Spel, НаеШ, HinGl («Fermentas», Литва); • • буферы для рестрикционных эндонуклеаз Red\ Orange"^ и Yellow"^ Tango («Fermentas»); Тад'-полимераза из Thermus aqiiaticus (предоставлена В.В.Мочаловым, г. Серпухов); • Р/г/-полимераза из Pyroco

Выделение тотальной ДНК Клеточная культура Lep. seymouri была выращена на среде STAR (инкубащ1я 7 дней при 25°С). Тотальн>то ДЬЖ выделяли по следующей методике: 1. Осаждали клетки па центрифуге J21C («Beckman») в роторе JA-20 10 мин при 8000 об/мин, супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 800 мкл буфера NET-25 (100 мМ NaCl, 25 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-НС1, рН 7,5-8,0). 2. Полученную на стадии 1 суспензию гомогенизировали пластмассовым пестиком (в 1,5 мл пробирках). Переносили в 2 мл про

Рестрикция кииетошшстной ДНК Реакцию проводили в термостате в течение 1-2 часов при температуре 37°С (для Bell при 50°С ). Рестрикционная смесь содержала: е ДНК, растворенную в mQ; • соответствующий рестриктазный буфер (10х, «Fermentas»); • рестриктазу - 3-5 единицы на 1 мкг ДНК; • mQ (если требовалось разбавление). Суммарный объем 10 мкл. Также проводились контрольные реакции с ДНК фага X для проверки рестриктаз. Затем продукты реакций рестрикции анализировались с помощью электрофореза в 1%

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР представляет собой ферментативную амплификацию фрагмента ДЬЖ, фланкированного двумя олигонуклеотидиыми праймерами, комплементарно связанными с противоположными цепями выбранного района ДНК. В качестве полимеризующего фермента используется 7aq ДНК-полимераза, выделяемая из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Фермент отличается высокой термостабильностью, что позволяет многократно повторять цикл реакций, включающий в себя денатурацию РОССИЙСКАЯ ГОСУДАР

Метод Long-PCR в присутствии бетаина с целью получения полной ДО В стантартной ПЦР, как правило, может быть а^мплифицирован фрагмент не длиннее 3 тпн. Таким образом, этот метод не может применятся для амплификации полноразмерной ДО, т.к. её размеры составляют около 7-20 тпн. Кроме этого, большое количество повторов создает сложную вторичную структуру, что мешает работе 7Ьг(7-полимеразы и значительно сокращает длину ПЦР продукта. Тем не менее, метод ПЦР может быть модифицирован для использован