Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71492

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ..36 40 43 43 47 48 67 J 67 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ ДСН-ПААГ — электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях; •г" CAT - хлорамфениколацетилтрансфераза; Luc - люцифераза; LacZ - Р-галактозидаза; GUS - Р-глюкуронидаза; • PNPG - п-нитрофенил глюкуронид; MUG - 4-метил-умбеллиферил-глюкуронид; X-gluc - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил глюкуронид; EGFP - модифицированный зеленый флуоресцентный белок; ИПТГ - изопропил-б(1-галак

Впервые термофильная анаэробная бактерия Clostridium thermocellum была описана Viljoen в 1926 году [МсВЕЕ, 1954]. С. thermocellum секретирует белки, объединяющиеся структура целлюлозы. Изучением ферментов целлюлолитического комплекса С. thermocellum занимаются во многих странах мира: В Израиле в Вейцмановском институте и в Биотехнологическом центре Тель-Авивского Университета, во Франции в Институте им. Пастера, в Германии в Институте Микробиологии Мюнхенского технологического университета, в

ГЛАВА 1. ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ЛИХЕНАЗА Clostridium КАК ПРЕДСТАВИТЕЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ thermocellum ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ: СВОЙСТВА И СТРУКТУРА Термостабильная лихеназа LicB (р-1,3;1,4-глюканаза (КФ

3.2.

1.73)) в природных условиях входит в состав целлюлосомного комплекса С. thermocellum и гидролизует эндо-р-1,4-гликозидные связи в полиглюканах со смешанными р-1,3; 1,4-гликозидными связями [Зверлов, 1993] (рис.

1.1). СНгОН —О НОч\з СЯгОН Ш СН2ОН СНгОН Рис.

1.1. Сайт гидр

ГЛАВА 2. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ В ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРР1КЛАДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Гликозилгидролазы, в частности, бактериальные термостабильные гликозилгидролазы, широко используются для изучения фолдинга белковых молекул, изучение каталитических и некаталитических модулей ферментов, изучение молекулярных основ термостабильности ферментов и др. В прикладном аспекте гликозилгидролазы также представляют интерес, поскольку могут осуществлять конверсию полисахаридов, которые составляют основ

В современной белковой инженерии активно развиваются два тесно связанных друг с другом направления: рациональный дизайн белковых молекул и направленная эволюция ферментов [Патрушев, 2004]. Основной целью первого направления является создание новых белков на основе исключительно теоретических представлений о свойствах будущей белковой молекулы [Solon., 2002]. Однако для реализации этого направления необходимы глубокие знания законов, определяющих соответствие между первичной и третичной структ

Важный аспект фундаментальных исследований ферментов из термофильных микроорганизмов - это изучение молекулярных основ их термостабильности. В обзоре Янике (1998) в отношении закономерностей, присущим белкам термофилов, дается следующее обобщение: 1. Белкам термофилов присущ высокий уровень стабильности: стабильность становится ограниченной при оптимальной температуре их функционировании, как и в случае белков мезофиллов. 2. Имеющиеся данные по структуре доказывают, что белки термофилов очен

В прикладном аспекте гликозилгидролазы представляют интерес, поскольку они могут осуществлять конверсию полисахаридов в ценные продукты [Sheehan & Himmel, 1999]. Возможность эффективного гидролиза целлюлозных субстратов гликозилгидролазами и определяет области их применения во многих биотехнологических процессах в самых различных отраслях производства [White et al., 1983; Loi et al., 1987]:

- в пищевой промышленности (производство соков, продуктов из сои, пивоварение, виноделие);

Заключение Таким образом, в настоящее время в белковой инженерии интенсивно развиваются два взаимосвязанных направления: рациональный дизайн и 29 направленная эволюция белковых молекул. Гликозилгидролазы термофильных бактерий являются удобными модельными объектами для реализации этих исследований. Области использования этих ферментов в фундаментальных и прикладных исследованиях могут быть расширены, если учитывать, что большинство из них, наряду с высокой удельной активностью, обладают таким

ГЛАВА 3. РЕПОРТЕРНЫЕ ДЛЯ СИСТЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ПРР1МЕНЕНИЯ ИЗУЧЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ АСПЕКТОВ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В последние годы определены последовательности геномов многих организмов (более 1300 геномов вирусов и вироидов, более 200 прокариот и эукариот), всего более 800 организмов данные (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/querv.fcgi?CMD=search&DB=genome, на ноябрь 2004). Однако расшифровка нуклеотидной последовательности не всегда дает полное представление о ее фун

Основа методологии репортерных систем проиллюстрирована на рисунке

3.1. Все гены имеют промоторные последовательности, которые методами молекулярной биологии, можно выделить и расположить в начало гетерологичного репортерного гена. Такая конструкция (промотор-репортер) может быть введена в клетки, и за активностью продукта репортерного гена можно проследить, используя различные методы. На этом примере (рис.

3.1.) показано, что активность промотора регулируется сигналом от рецепто

Методология репортерных систем позволяет осуществлять контроль за временной и пространственной экспрессией генов во время таких сложных процессов как клеточный цикл, при воздействии на клетки гормонами, факторами роста, питательными веществами, факторами внешней среды; 33 изучать механизмы сортировки, транспорта и внутриклеточной локализации белков; проводить проверки большого числа клеточных линий к лекарственной чувствительности или устойчивости; осуществлять слежение за «доставкой» генов (

3.2.1. Изучение активности и индуцибельности промоторов и регуляторных элементов (транскрипционные репортеры) В этой области используются те репортерные системы, которые имеют простые высокочувствительные количественные методы определения активности репортерного белка, и, вместе с тем, позволяют проводить динамические исследования включения и выключения транскрипции (имеют небольшой период полужизни и/или время созревания продукта, чтобы быстрые изменения транскрипции репортерного гена приво

Для этих целей используется следующая стратегия: создается конструкция, в которой последовательность репортерного гена не контролируется каким-либо регуляторным элементом. Данной конструкцией трансформируют клетки исследуемого организма, и присутствие свидетельствует репортерного о том, что белка в трансформированных клетках встройка последовательности репортерного гена произошла таким образом, что его экспрессия контролируется промотором в геноме клетки-хозяина. Анализ размера мРНК репор

3.2.3. Определение локализации продуктов исследуемых генов (трансляционные репортеры) Используя репортерные системы, можно определять локализацию продукта изучаемого гена. Такие исследования проводятся с использованием химерных последовательностей, которые состоят из последовательности репортерного гена, слитой в рамке считывания либо с последовательностью, кодирующей интересующий продукт, либо с последовательностью, которая кодирует лидерные пептиды. Благодаря лидерным сигналам клеточны

3.2.4. Система доставки генов или продуктов генов к клеткам-мишеням. Гемотерапия Репортерные системы используются как маркеры для мониторинга транспорта и локализации трансгена (генотерапия), т.е. позволяют определять «успешную» доставку генов к тем или иным клеткам и их функционирование. Для этих целей используют бицистронные вектора, которые экспрессируют репортерный ген, и ген, который интересует исследователя (gene of interest). Методология репортерных систем широко используется и для выя

3.3. Основные репортерные системы: преимущества и недостатки К репортерным генам и их продуктам предъявляется ряд требований. Одно из них - простота и высокая чувствительность количественных и качественных методов определения активности репортерного белка на фоне других клеточных компонентов. Немаловажные факторы это возможность проводить динамические наблюдения, как увеличения, так и уменьшения экспрессии генов (в этом случае важными характеристиками являются период полужизни и/или время со

1. Р-глюкуронидаза (GUS) E.coli Р-глюкуронидаза (ген uidA) E.coli (EC

3.2.

1.31) - это гидролаза, катализирующая гидролиз гликозидных связей в различных Р-глюкуронидах (рис.

3.2). Молекулярная масса мономера белка составляет 68,2 кДа (603 а.о.), но на ДСН-ПААГ электрофорезе белок имеет молекулярную массу ~74кДа [Jefferson et al., 1986; Jefferson et al., 1987a]. COOH COOH OOH OH OH OH \ *" V OH ^ OH — + R R OH Рис.

3.2. Схема реакции катализируемой Р-г

GFP - уникальный белок, способный испускать зеленый свет (509

им) при его освещении ультрафиолетом или синим светом (395, 475

нм) [Chalfie et al., 1994]. Белок состоит из 238 аминокислотных остатков (27-30 кДа), которые формируют трехмерную структуру P-barrel [Ormo et al., 1996] (рис.

3.3). Рис.

3.3. Трехмерная структура GFP А. victoria (по данным http://www.expasY.org/swissmod/SWISS-MODEL.html). Красным обозначен N- конец, синим Сконец белковой глобулы. ••^(.'ССИЙ

Механизм фотоизомеризации GFP. Состояние А преимущественно в GFP дикого типа, состояние В формируется в мутанте S65T, состояние I - промежуточное состояние. Изменения от А к I отмечены синим цветом, различия между I и В красным [Brejcetal, 1997]. Это сделано для расширения возможностей использования GFP, поскольку в некоторых организмах часто наблюдается эндогенная спектрами испускания, аналогичными GFP. флуоресценция со Используя специальное оборудование, можно следить за экспрессией GF

Недавно 6 GFP-подобных белков были клонированы из небиолюминесцентных видов кораллов Anthozoa [Matz et al., 1999]. Два (zFP538 и drFP583) из них имели пик испускания света в желтой и красной области (538 и 583 нм), что отличает их от GFP А. victoria, пик испускания которого лежит в зеленой области (509 нм). Эти белки являются удобными репортерами для одновременного слежения за экспрессией двух регуляторных элементов. Важной характеристикой этих белков является также их более высокая стабильн

Новая репортерная система, основанная на термостабильности лихеназы С.thermocellum, была разработана в лаборатории генетической инженерии растений (на сегодняшний день лаборатория функциональной геномики) Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, руководимой профессором Э.С. Пирузян [Piruzian et al., 1998; Пирузян, 2000]. Лихеназа р-1,3;1,4-глюканаза (КФ

3.2.

1.73) гидролизу ет р-1,4-гликозидные связи в полиглюканах со смешанными Р-1,3 и р -1,4-связями. На рис.

1.5 пр

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные и дрожжевые штаммы: Е. coli: XL 1-Blue ("Stratagene", USA): recAl endAl gyrA96 thi-l hsdR17 supE44 relAl lac [F proAB lacPZiMlS TnlOCTet'^)]; BL21(DE3) ("Novagene", USA) F" dcm ompT hsdSir^- m^-) gal к (DE3); Saccharomyces cerevisiae YPH 857 {Mat^ ade 2-101 lys 2-81 ura 3-52 trp 163 leu 2-1 his 3-200). В качестве полноценной жидкой и твердой (1,5% агар) среды для выращивания клеток Е.соП использовали LB-среду Ман

Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЯ Как уже упоминалось в ГЛАВЕ 3, одной из основных задач исследований в области молекулярной и клеточной биологии является расшифровка клеточных процессов и регуляции экспрессии генов в отдельной клетке или в организме в целом. Экспрессия генов может регулироваться на разных уровнях и для ее изучения используется множество молекулярно-биологических методов, в том числе стратегия репортерных систем. Основные области применения репортерных систем - изучение актив