Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

p53-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках с диким типом p53 : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71486

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

1

1

12 II.

3.3

14

15

1 П.5 П.6 П.7 П.8 П.9 НЛО П.

10.1 П.

10.2 П.П ПЛ2 П.13 11Л4 11Л5 ПЛб 11Л7 11Л8 III. ХИЛ Ш.2 ^ ^ ^ ; , ^ ( ^ III.3 III.4 IIL5 III.6 v< IIL7 IV. V. тепловым шоком Векторы и плазмидные конструкции HIF-la-чувствительные репортерные плазмиды HSF-1-чуБствительные репортерные плазмиды р53-чувствительные репортерные плазмиды Плазмиды, эксирессирующие siRNA Получение конструкций, экспрессирующих р53 с FLAG последовательностью аминокислот на С или N конце Обработка ДНК рестрикцион

р53 - центральный компонент сигнальных путей, ограничивающих злокачественный рост клеток

Последствия инактивации гена р53 Функция р53 не является строго необходимой для нормального развития и функционирования организма: полное выключение экспрессии гена р53 с помощью технологии генного нокаута приводит к рождению жизнеспособных мышей. Однако такие мыши редко доживают до шестимесячного возраста, поскольку у них развиваются злокачественные опухоли [7]. Культивируемые клетки р53 -/- мышей отличаются чрезвычайной геномной нестабильностью и демонстрируют значительные изменения кариоти

Биологическая роль гена р53 Белок р53 координирует все основные процессы поддержания стабильности генома многоклеточного организма, за что он получил название «страж генома» [10]. Несмотря на чрезвычайную сложность многоклеточного организма, все клетки в нем генетически однородны. Это является результатом не только высокой точности репликации ДНК и эффективности репаративных систем, но и в значительной мере следствием постоянно идущих процессов, приводящих к клеточной смерти, благодаря которы

Функции, строение молекулы и активация белка р53 р53 представляет собой полифункциональный белок, основная функция которого осуществляется в ядре. Ген р53 постоянно транскрибируется и транслируется, однако сам белок быстро подвергается убиквитин-зависимой деградации в протеосомах [16, 17]. Поэтому в клетках большинства тканей уровень белка чрезвычайно низок и находится на пороге детекции. Повышение функциональной активности белка р53 в ответ на разнообразные стрессы и повреждения происходит г

Транскрипционные мишени белка р53 р53 способен оказывать комплексное воздействие на транскрипцию генов, активируя экспрессию одних, и репрессируя другие. Транскрипционная репрессия является функцией С-концевой части молекулы р53 [44] и, отчасти, обусловлена способностью к связыванию с базальным компонентом транскрипционного аппарата — фактором ТВР (ТАТА-Вох Binding Protein) [45] и подавлением активности комплексов TFIID и TFIIID [46]. Тем самым частично подавляются активности РНК-полимеразы I

Латентное и активированное состояние белка р53 Как уже говорилось, в условиях нормального клеточного роста и метаболизма содержание и активность р53 невелики. В некоторых типах клеток р53 может находиться в заметных количествах (детектируемых Вестерн-блот анализом), но при этом он находится в неактивной - латентной форме. Латентная форма р53 лишена способности активации транскрипции р53-чувствительных генов. Однако это не означает, что, находясь в латентной форме, р53 полностью лишен какой-ли

Активация р53 в ответ на стрессы Нарушения описанных выше механизмов сдерживания активности р53 происходят в ответ на многочисленные стрессовые ситуации. Стабилизация р53 достигается за счет ковалентной модификации N-концевой части р53 или связывания с регуляторами взаимодействия р53 и MDM2 [5]. В ответ на повреждения ДНК происходит фосфорилирование участка связывания с MDM2. Другой механизм использует связывание с p53/MDM2 комплексом белка ARF (pl9-ARF мыши и pl4-ARF человека), продуктом аль

Белки, физически взаимодействующие с белком р53 и модулирующие его функции

1 HIF-1-зависимый сигнальный путь Интерес к роли индуцируемого гипоксией фактора 1 (HIF-1, Hypoxia-inducible factor

1) в раковой биологии растет с экспоненциальной быстротой с момента его идентификации [139], биохимической очистки [140] и характеристики на молекулярном уровне [141]. Многие данные о клеточной и молекулярной биологии HIF-1 и его роли в прогрессии человеческого рака были получены совсем недавно в экспериментах на животных моделях и анализе раковых биопсий человека.

Структура белка HIF-la главного регулятора кислородного гомеостаза Транскрипционный фактор ШР-1 осуществляет индукцию адаптивных ответов на изменения снабжения кислородом тканей. Он состоит из двух субъединиц, HIF-la и HIFip. Анализ аминокислотной последовательности показал, что обе субъединицы относятся к семейству bHLH-PAS-белков (bHLH, basic helix-loop-helix основной домен, организованный по принципу спираль-петля-спираль; PAS - назван по первым буквам трех белков, в которых он был впервые

1.3.

02-зависимая регуляция активности HIF-la Как было сказано выше, концентрация Ог регулирует скорость деградации HIF-la. Белок HIF-la имеет несколько аминокислотных остатков, которые подвергаются вторичным модификациям в зависимости от концентрации кислорода, или иных стрессовых воздействий. В условиях нормоксии, Ог-зависимое гидроксилирование пролиновых (Pro) а.о. 402 и 564 белка HIF-la пролиловыми гидроксилазами 1-3 (PHD 1-3) приводит к связыванию с белком опухолевого супрессора VHL, который

1.3 Транскрипционные мишени HIF-1 Бьшо идентифицировано более 60 генов-мишеней, транскрипция которых активируется непосредственно HIF-1 (рис.5). Эти гены были идентифицированы на основании следующих наблюдений: 1. В регуляторных областях этих генов были найдены цис-действующие ДНК-элементы, которые содержали HIF-1 связывающие последовательности - HRE [139]; 2. Потеря этими генами экспрессии в HIF-la -/- клетках [162-164] или клетках, экспрессирующих малые интерферирующие РНК (siRNA, sm

Роль р53 в ответе клетки на действие гипоксии Гипоксия стабилизирует белок р53 за счет механизмов, отличных от ДНКповреждающих воздействий [132]. Стабилизация и активация р53 в ответ на гипоксию происходит только в условиях жесткой гипоксии (

0.02%

Ог) или при обработке веществами, имитирующими гипоксию, и не наблюдается в более мягких условиях (2%

Ог) [138, 173, 174]. При этом происходит фосфорилирование р53 по Ser 15 и 37 [174, 175]. Фосфорилирование по этим а.о. играет су

1.), ни для одного из них не показаны ни активация в ответ на гипоксию, ни участие в индуцированном гипоксией апоптозе. Недавно было показано [181], что ген Peg3/Pwl, обладающий проапоптотической активностью, является р53-зависимым геном и индуцируется в ответ на гипоксию/ишемию в мозге. При этом он колокализуется с белком р53 в гипоксических участках, что делает его вероятным посредником р53-зависимой индуцированной гипоксией клеточной гибели. Другим посредником может быть р53-зависимый ген

Роль р53 в регуляции активности HIF-1 Помимо участия в индукции клеточной смерти, р53 может играть важную роль в регуляции активности транскрипционного фактора HIF-1. Так, было показано, что р53 способен ингибировать белком с HIF-1-зависимую гистонацетилазной транскрипцию активностью [185]. Этот процесс опосредуется рЗОО, являющимся транскрипционным коактиватором как для р53, так и для HIF-1 [186, 187]. Также, р53 способен непосредственно связываться с HIF-la субъединицей и МВМ2-опосредованн

2 HSF-1-зависимый сигнальный путь и белки теплового шока Конформационная гибкость белков является амортизатором при каком-либо повреждающем клетку воздействии. Устойчивость клеток к цитотоксическим факторам определяется способностью белковых молекул к самовосстановлению своей структуры и функции. Огромное количество факторов способно индуцировать белки теплового шока (HSP, heat-shock protein), что демонстрирует универсальность этого механизма клеточного ответа на стресс. HSP могут существоват

Регуляция экспрессии HSP Перед генами HSP, в их так называемой 5' нетранскрибируемой области, находятся участки ДНК, содержащие последовательности nGAAn (HSE), которые должны узнаваться определенными факторами (HSF). В 5' нетранскрибируемых областях генов HSP присутствует различное количество HSE, причем некоторые из последних соединены по типу "голова к голове", или "хвост к хвосту" [199]. К настоящему времени выявлены четыре различньк HSF, которые могут сосуществовать в

Локализация HSP Семейство молекулярных щаперонов HSP90 включает в себя HSP90, который локализуется в цитоплазме и ядре и регулируемый глюкозой белок 94 (GRP94, glucoseregulated protein

94) или эндоплазмин, который находится в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР). HSP70 семейство включает в себя большое число компонентов: HSP68, HSP70, HSP71, HSP72, GRP34, 47, 56, 75 и 78, находящихся в различных клеточных компартментах. Некоторые HSP70 содержат дополнительный N-концевой домен для трансло

Экспрессия HSP в раковых клетках Измененная экспрессия HSP была описана почти для всех типов рака. Эти наблюдения не дали ответа на вопрос о том, является ли измененная экспрессия HSP причиной опухолевой прогрессии или коррелирует с ней. Вероятная роль HSP в опухолеобразовании заключается в том, что они являются модификаторами белковых активностей, особенно это касается компонентов, связанных с клеточным циклом, киназ и других белков, вовлеченных в опухолевую прогрессию. HSP70 был найден в ко

2.4 HSP и р53

1.3.

2.4.1 Возможные механизмы стабилизации белка р53 Дикий тип белка р53 (дт-р53) в норме является очень короткоживущим белком, причем время его жизни составляет менее 30 минут. При повреждении клеточной ДНК или при определенных других стрессовых воздействиях, уровень дт-р53 в клетке быстро растет, главным образом, за счет стабилизации этого белка, а не за счет усиления транскрипции соответствующего гена или трансляции мРНК [208, 209]. Известно, что стабильно

1.,

4.2 Стабилизация мут-р53 за счет ассоциации с HSP90 Известно, что дт-р53 является убиквитинируемым белком и подвергается протеолизу в протеосомах. Протеолиз через убиквитин-протеосомный путь происходит в два этапа: 1. идентификация субстрата и его убиквитинация убиквитин-протеин лигазами, 2. узнавание убиквитинированного субстрата и его деградация протеосомой. Только 45 малая часть мутантного белка р53 подвергается процессу убиквитинирования [221, 222], а убиквитинированные формы му

Технология репортерных генов Термин «репортерный белок» используется для обозначения белка с ярко выраженным фенотипом. Такой белок может быть легко детектирован на фоне других эндогенных белков [245]. Обычно, в качестве репортерных используются белки, удовлетворяющие легкость детекции следующим (доступность требованиям: легких и 1. чувствительность (изменение концентрации/активности даже в ответ на сравнительно малый стимул/воздействие), 2. количественных калориметрических, флуоресцентных и

Репортерные гены В таблице 1 сравниваются наиболее широко используемые репортерные гены [246, 248, 249]. В общих чертах, преимущество репортерных генов заключается в низком базальном уровне экспрессии в клетках. При передаче сигнала от клеточной поверхности внутрь клетки происходит амплификация сигнала, что приводит к высокочувствительному и легко детектируемому повышению уровня репортерного белка. Выбор репортера, однако, зависит от целей и дизайна конкретного эксперимента: от 52 клеточной л

Применение репортерной технологии

Введение экзогенного генетического материала в клетки и экспрессия генов

3. Анализ промоторов Технология репортерных генов впервые была применена для изучения активности цис-действующих генетических элементов, таких как энхансеры и промоторы генов. Например, так были локализованы транскрипционные элементы, ответственные за базальную и тканеспецифичную экспрессию генов-рецепторов для СС хемокина, ангиотензина II (тип 1), интерлейкинов 2 и 5. Также были идентифицированы промоторные последовательности, отвечающие на повышение концентрации эстрогенов, андрогенов, тиро

Мониторинг эффективности трансфекции (доставки трансгенов внутрь клеток) Репортерные гены используются в качестве маркеров для мониторинга эффективности трансфекции различных генов в клетки. Бицистронные векторы, экспрессирующие как репортер, так и изучаемый ген, можно применять для мониторинга доставки гена внутрь клетки и как стратегию скрининга для отбора трансфицированных клеток [250]. Например, FACS (fluorescense-activated cell sorting) анализ очень удббен для детекции трансфицированных

Визуализация генной экспрессии Исторически, пространственная организация генной экспрессии у растений и животных оценивалась при помощи калориметрических и флюорометрических методов детекции р-глюкуронидазы и р-галактозидазы в качестве маркеров. Однако, развитие технологий с использованием люциферазы и GFP в качестве неинвазивных маркеров генной экспрессии, детектируемых с помощью флуоресцентной микроскопии, позволило получать информацию о временной и пространственной экспрессии генов даже на

3.2 Биологические скрининги и открытие химических соединений Чувствительность, надежность, легкость, воспроизводимость и адаптивность технологии репортерных генов к массовому скринингу химических соединений на клеточных культурах сделали подобный скрининг очень притягательной альтернативой биохимических экспериментов in vitro [249]. Принципиальное преимущество скрининга на клеточных культурах заключается в том, что он, с одной стороны, является рутинным, а с другой может давать информа

Характеристика рецепторов и их лигандов Технология репортерных генов была успешно применена для клонирования, экспрессии и характеристики как мембраносвязанных, так и внутриклеточных рецепторов [255]. Такие исследования оказались очень конструктивными применительно к идентификации лигандов-агонистов и антагонистов, способных изменять активность рецептора в живых клетках. Хорошим примером подобного рода исследований является изучение суперсемейства рецепторов, ассоциированных с G-белками (GPCR

Изучение сигнальных путей Поскольку транскрипция генов играет важную роль в регуляции клеточной активности, транскрипционные факторы и белки, участвующие в передаче сигнала, стали одними из главных терапевтических мишеней [259]. Причем использование репортерной технологии играет важную роль в открытии не только новых химических соединений, специфически действующих на определенные мишени, но и новых мишеней. Это ведет к лучшему пониманию молекулярных основ заболеваний человека, что способствуе

3.2.3 Применение репортерной технологии в токсикологии Доступность стабильно трансфицированных репортером клеточных линий дала возможность проводить биологические скрининги по измерению цитотоксичности. При этом секреция репортера используется для измерения порообразования и, таким образом, жизнеспособности клеточных линий [260]. В данных исследованиях обычно используются репортеры на основе |3-галактозидазы или люциферазы, детектируемые при помощи калориметрических и люминесцентных ме

0 Окраска клеток на р-галактозидазу

11.10.1 X-gal окрашивание Клетки, содержащие репортерные плазмиды с р-галактозидазой в качестве репортерного белка, рассаживали на 12- или 24-луночные плашки в плотности 1/5 от монослоя и инкубировали в течение ночи в инкубаторе. Затем клетки обрабатывали ДНКповреждающими соединениями, ДФО или тепловым шоком, промывали ФСБ, фиксировали холодным раствором

0.5% глутарового альдегида и 1 мМ MgCb в ФСБ и окрашивали раствором, содержащим 1 мМ MgCh, 3

2

1.5 -^14 28 — 1 '

0.5 П - ^ ^ ^>-56 -0-113 -•-225 -О-450 1 24 Рис.14 Динамика транскрипционной активности HIF-1 фактора в ходе обработки клеток ДФО в различных концентрациях и в течение различных промежутков времени. Н1299/ (а), HEF/ (б) и HCT116/pSIP-HRE12-mHsp70-lacZ (в) линии клеток обработывали ДФО в различных концентрациях (указанных справа от каждого графика, мкМ) и в течение различных промежутков времени (указаны на оси абсцисс, ч). На оси ординат показано число ра