Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Канонические и неканонические последовательности эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в геноме дрозофилы : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2005

Номер работы: 71485

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

2.2. СТРОЕНИЕ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ

Не-ДКП-ретротранспозоны широко распространены у эукариот (животных и растениях, но не у дрожжей). Впервые они были обнаружены у млекопитающих и получили название длинные рассеянные ядерные элементы (long interspersed nuclear elements - LINE), поэтому таьсие мобильные элементы дрозофилы часто называют LINE-подобными. В настоящее время известно около 10 семейств таких ретротранспозонов, причем чаще всего они представлены в геноме дефектными копиями, усеченными с 5'-конца [Finnegan, 1989]. Не-ДК

2.2.2. Струюурная характеристика ДКП-ретротранспозонов Подобно ретровирусам позвоночных, ретротранспозоны дрозофилы несут на концах идентичные друг другу длинные концевые прямые повторы (ДКП). Длина ДКП различных ретротранспозонов варьирует от 250 до 500 п.н. (необычно длинные ДКП — 2100 п.н.

- имеет Ulysses [Evgen'ev et al, 1992J). ДКП значительно менее консервативны по сравнению с внутренними областями ретротранспозонов, особенно с кодирующими последовательностями. Абсолютная идентич

2.3. РОЛЬ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ГЕНОМА

2.3.1. Ретротранспозоны как фактор поддержания целостности генома Ретротранспозоны локализуются в геноме как в эухроматине, так и в гетерохроматине, играющем ключевую роль в формировании центромерных и теломерных районов хромосом. Гетерохроматин обладает не только особыми цитологическими свойствами, но и имеет очень разнообразную структуру на молекулярном уровне. Особенностью этого компонента генома эукариот является обилие повторяющихся сателлитных ДНК, последовательностей: сложно сильно пов

Влияние МГЭ на генетическую изменчивость организмов очень значимо. Еще Барбара МакКлинток в ходе работы с контролирующими Ac-Ds элементами у кукурузы показала, что мобильные элементы могут вызывать хромосомные перестройки [McClintock, 1956]. Параллельное расположение мобильных элементов на гомологичных хромосомах в результате рекомбинации может приводить к появлению делении в одной хромосоме и дупликации - в другой. Рекомбинация между элементами внутри одной хромосомы приведет к выпадению уч

2.4. РЕТРОТРАНСПОЗОН МДГ4 И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ

МДГ4 - один из наиболее изученных ретротранспозонов дрозофилы. Он имеет ДКП длиной 482 п.н. и три открытых рамки считывания [Bayev et al, 1984, Marlor et al, 1986]. Основную часть «тела» МДГ4 занимают ОРС, гомологичные ретровирусными генам gag, pol и env. ОРС, кодирующие gag и /?о/-продукты, слегка перекрываются (рис.4). Экспрессия />о/-продукта осуществляется в составе gag-pol полипептида после сдвига рибосомы при транслящ1и. Третья ОРС экспрессируется через сплайсинг основного транскрипт

1.1. Белковые продукты открытых рамок считывания МДГ4 Все эндогенные ретровирусы насекомых (IERV - Insect Endogenous Retroviruses or Insect ErrantiViruses) можно разделить на две подгруппы, которые отличаются друг от друга последовательностью сайта связывания с праймером (PBS - primer binding site). МДГ4 (gypsy) относится к lERV-K подгруппе, для элементов которой характерно использование в качестве праймера для обратной транскрипции лизиновой т-РНК. Представители второй подгруппы - IERV-S -

1.1.1. Ген gag и его продукты Сборка ретровируса и транспорт ретровирусной частицы из клетки определены структурным полипротеином GAG. Последовательность гена gag наименее консервативна по сравнению с другими ОРС ретроэлементов, поэтому биология молекулярных взаимодействий, приводящих к мультимеризации мономеров GAG в незрелую вирусную частицу и выходу частиц ретровируса из клетки, до сих пор остается малоизученной [Сёмин, Ильин, 2004]. Исследования последних лет показывают, что большинство

Протеаза Протеаза {Рг) является одним из ключевых ферментов, участвующих в перемещении ретроэлементов. Она синтезируется вместе с другими белками, кодируемыми ОРС ретровирусов, в виде полипротеинового предшественника, который впоследствии специфически расщепляется при помощи собственной протеазной активности на функциональные единицы Рг, RT, RH, Int . Активные ретровирусные протеазы являются гомодимерами. В большинстве случаев трансляция ретровирусной gag-pol мРНК обрывается до начала ро1-ген

1.1.3.Ген env ОРСЗ (ген env), как и у ретровирусов, экспрессируется с помощью сплайсинга основного транскрипта. ОРСЗ ретровирусов кодирует компоненты, которые ответственны за взаимодействие вирусной частицы с мембранными рецепторами клетки, в результате чего вирус проникает в нее [Varmus, Brown, 1989]. Раньше считали, что основным различием ретровирусов и ретротранспозонов является именно наличие гена env. Однако были найдены несколько семейств ретротранспозонов с ОРСЗ. Это МДГ4, 297,

2.4.2. Генетическая нестабильность в мутаторной линии MS Drosophila melanogaster Мутаторная линия MS (Mutator Strain) была получена А.И. Кимом из стабильной лабораторной white линии SS (Stable Strain) в результате обработки ее нитрозоэтилмочевиной [Kim et al, 1990; Kim, Belyaeva, 1991]. Обработанные мутагеном самцы линии white были скрещены с самками линии со сцепленными Xхромосомами для выявления особей с дефектом системы репарации ДНК. Отобранный самец был использован для выведения лини

Для исследования структуры МДГ4 в линии MS и исходной для неё стабильной линии SS, копии мобильного элемента были клонированы из обеих линий [Lyubomirskaya et al, 1990]. Сравнительный анализ клонов выявил существование двух подсемейств МДГ4, имеющих четкие структурные отличия. Эти два подсемейства, условно названные «активным» и «неактивным», существенно различаются по эффективности амплификащ1и в культуре клеток дрозофилы [Lyubomirskaya et al, 1993], а также по представленности в геноме мух

2.4.4. Ген flamenco - регулятор транспозиции МДГ4 Присутствие транспозиционно активного варианта МДГ4 необходимо, но не достаточно для высокой частоты транспозиции, т.к. оба подсемейства могут сосуществовать в одном геноме без повьш1ения частоты перемещений. Вероятно, должен быть какой-то ген или гены в геноме клетки-хозяина, регулирующие транспозиции МДГ4. Для проверки этого предположения и исключения влияния /го^)о-элемента, перемещения которого в линии MS также происходят с повышенной част

2.4.5. Сравнение ретротранспозиционной активности двух вариантов МДГ4 Для выяснения способности двух вариантов МДГ4 к транспозициям и выявления значимости для этого процесса аминокислотных замен в кодирующей части «активного» МДГ4 была использована особая модельная система, позволяющая регистрировать образование новых копий мобильного элемента, возникающих в процессе обратной транскрипции конструкций, введённых в культуру клеток Drosophila hydei. В геноме этого вида дрозофилы отсутствуют пос

2.4.6. Распределение двух вариантов МДГ4 в различных линиях Drosophila melanogaster Открытие двух подсемейств МДГ4 вызвало особый интерес к исследованию их эволюционных взаимоотношений. Был проведен рестриктный анализ копий этого элемента в разных линиях D. melanogaster [Кусуяиду и др.,200}; Разоренова и др.,200}]. В качестве молекулярного маркера, позволяющего различать два подсемейства ретротранспозона, использовался сайт Hindlll (4483), присутствующий только в «активном» подсемействе [Baye

3.1. ШТАММЫ Е. СоИ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ.

1) XLl-Blue (для трансформации плазмидной ДНК) фирмы Stratagene: recAl, endAl, gyrA96. thi-1, hsdR17, supE44, relAl, lac, [F'proAB, lacPZDMlS, TnlO (tef)].

2) XLl-Blue MRA (для заражения рекомбинантными бактериофагами): Л(тсгА)183, A(mcrCB-hsdSMR-mrr)I73, endAl, supE44,thi-l, gyrA96, relAl, lac.

3) XLl-Blue MRA (P2) (для селекции против родительских бактериофагов): то же, что XLl-Blue MRA но лизогенный по бактериофагу Р2.

3.2. ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ В работе были использованы следующие праймеры для секвенирования:

1) ТЗ (17-тег) и 77 (20-тег) promoter sequencing primer для плазмидного bCKiopupBluescript II SK(-), производимые фирмой MBI Fermentas;

2) праймер из области PvuII/Kpnl MДГ4(gy/7j;y) (положения нуклеотидов 26962714); 5'd(GAATACCAGGGCATCGCTG)3'.

3) праймер из gtwin, области для ОРСЗ поиска (положения стоп-кодона нуклеотидов в 6184-6166) 6117; ретротранспозона положении

3.4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

3.4.1. Приготовление компетентных плазмидной ДНК Из коллекции, хранящейся в жидком азоте, высевали методом истощающего штриха штамм Е.соИ XL 1-Blue на чашку с LB агаром и тетрациклином. Инкубировали чашку при 37°С до появления крупных колоний (16-20 часов). Переносили 10 колоний в 250 мл среды SOB (на один литр среды: 20 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl; доводили рН до 7,5 с помощью КОН и автоклавировали; непосредственно перед

3.4.2. Приготовление бактерий для заражения ба1аериофагом Я Из коллекции, хранящейся в жидком азоте, высевали методом истощающего штриха штаммы E.coli XLl-Blue MRA и XLl-Blue MRA (P2) на разные чашки с LB агаром. Инкубировали чашки при 3'fC до появления крупных колоний (12-18 часов). Последующие этапы приготовления бактерий для заражения бактериофагом X не отличаются для штаммов Е.соИ XLl-Blue MRA и XLl-Blue MRA (Р2) [Маниатис и др., 1982]. Засевали отдельной колонией бактерий 30 мл жидкой бо

3.5.1. Заражение Е. соИ бактериофагом X Стерильно смешивали 40 мкл суспензии бактериофагов, предназначенных для скрининга, с 0,2 мл суспензии высеваемых бактерий: штамм XL 1-Blue MRA (Р2) Е. coli (этот штамм используют для селекции против нерекомбинантных фагов). Количество суспензии бактериофага X для заражения подбиралось таким образом, чтобы на чашке образовывались отдельные бляшки. Инкубировали 30 мин при 37^С. Добавляли 6 мл расплавленной (50"С) верхней агарозы (на 1 л среды (рН 7,5

3.5.2. Перенос молекул неупакованной ДНК бактериофага X на нейлоновый фильтр Охлаждали чашки, выдерживая их 1ч при 4°С, чтобы верхняя агароза затвердела. Вырезали круглые нейлоновые фильтры по размеру чашек и нумеровали их. Стерильно накладывали нейлоновые фильтры на чашки. Ассиметрично метили фильтры и агар под ними раскаленной в пламени горелки иглой. Через 60 сек. снимали фильтры пинцетом и высушивали их при комнатной температуре. Помещали фильтры (с ДНК на верхней стороне) в ванночку с д

Для приготовления радиоактивного ДНК-зонда использовали фрагменты, полученные в результате обработки плазмидной ДНК специфическими 1,5 М NaCl ) на 5 мин. Высушивали фильтры при комнатной рестрикционными эндонуклеазами (см. пункт

3.7.1.). Выделение фрагмента ДНК для приготовления радиоактивного зонда Выделение фрагментов ДНК из геля осуществляли с использованием фирменного набора MBIFERMENTAS DNA EXTRACTION К1Т#К0513. Проводили электрофорез Д1Ж в агарозном геле (использовался 1 *ТАЕ-бу

3.5.4. Гибридизация Фильтр с иммобилизованной на нем ДНК помещали в гибридизационный пакет и добавляли 3-5 мл гибридизационного раствора (5*раствор Денхардта (50*: 5 г фикола; 5 г поливинилпирролидона; 5 г BSA; вода - до 500 мл), 5* - 6*SSC и 0,5 % SDS). Запаивали пакет. Заворачивали пакет с фильтром в мокрую фильтровальную бумагу, помещали в полиэтиленовый пакет и инкубировали несколько часов (минимум 4 часа) при +65°С (предгибридизация). Вскрывали пакет и выливали гибридизационный раствор.

3.6. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

3.6.1. Выделение плазмидной ДНК Бактерии для последующего вьщеления плазмидной ДЬЖ выращивали на жидкой богатой среде LB: 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 600 мкл ЮМ NaOH на 1 л среды с антибиотиком (рН 7,5). Твердые богатые питательные среды для выращивания бактерий в чашках Петри готовили на среде LB с добавлением 1,5% бакто-агара. Ампициллин использовали в концентрации 50 мкг/мл (25 мг/мл - 500* раствор) как для твердых, так и для жидких сред. Трансформацию клеток

3.6.2. Выделение ДНК фага Я. Заражали бактерии штамма XL 1-Blue MRA E.coli бактериофагом X (см. пункт

3.5.1.) и инкубировали при ЗТ^С, добиваясь полного лизиса на чашках. Выделеьше ДНК для каждого клона, содержащего последовательность, гомологичную МДГ4, производилось с двух чашек (d 90 мм). Наливали в каждую чашку по 4 мл среды SM (5,8 г NaCl, 2 г MgS04x7 Н2О, 50 мл 1М трис-НС1 (рН 7,5), 5 мл 2 % желатина), инкубировали при 37^0 в течении двух часов при непрерывном покачивании. Тщате

Замораживали мух (около 200мг) в жидком азоте. Наливали немного азота в фарфоровую ступку и высыпали в нее мух. Охлажденным пестиком растирали мух в пудру, подливая азот по мере испарения. Переносили пудру в пластиковую пробирку на 50 мл с предварительно налитым в нее гомогенизирующим буфером НВ (7 мл буфера на 1 г мух). Состав буфера НВ: 0,1 М Tris-HCl, рН 2 М раствора 7,5 - 8,0; 10 т М ЭДТА, рН 0,5 М раствора 7,5; 0,35 М NaCl; 2% SDS; 7 М мочевина. Тщательно суспендировали. Добавляли 1 объе

3.7.1. Рестрикция плазмидной ДНК Рестрикцию плазмидной ДНК проводили в объеме реакционной смеси 20 мкл. В пробирке на

1.5 мл смешивали: 2 мкл соответствующего 10* буфера для рестрикционной эндонуклеазы (подбирался по каталогу); 0,5-1 мкл фермента (рестрикционной эндонуклеазы) - 5-10 ед.; 2,5-5мкг плазмидной ДНК, растворенной в деионизированной воды. Общее время рестрикции плазмидной ДНК составляло 1,5-2 часа при 37°С.

Рестрикцию ДНК фага X проводили в объеме 20 мкл. В пробирке на

1.5 мл смешивали: 2 мкл соответствующего 10* буфера для рестрикционной эндонуклеазы (подбирался по каталогу); 1 мкл фермента (рестрикционной эндонуклеазы) -10 ед.; 0,1 мкг ДНК фага Л,, растворенной в 17 мкл автоклавированной 17 мкл автоклавированной деионизированной воды. Инкубировали 1,5-2 часа при 37°С. Добавляли еще 1 мкл фермента, тщательно перемешивали и инкубировали 1,5-2 часа при 37°С. Общее время рестрикции ДНК бакт

Рестрикцию геномной ДНК дрозофилы проводили в два этапа. В пробирке на

1.5 мл смешивали: 3 мкл соответствующего 10* буфера для рестрикционной эндонуклеазы (подбирался по каталогу); 3 мкл фермента (рестрикционной эндонуклеазы) - 30 ед.; 5-10 мкг геномной ДНК дрозофилы, растворенной в 24 мкл автоклавированной деионизированной воды. Инкубировали 3-4 часа при 37°С. Добавляли еще 20 мкл рестрикционной смеси: 2 мкл соответствующего 10* буфера для рестрикционной эндонуклеазы; 2 мкл фермента;

3.8. ЛИГИРОВАНИЕ Для лигирования рестрикционных фрагментов с векторной ДНК использовали Т4 ДНК лигазу. Относительную концентрацию векторной ДНК и рестрикционных фрагментов определяли на спектрофотометре. В микроцентрифужной пробирке смешивали: 10* буфер для лигирования (400 т М Tris-HCl; 100 т М MgCb; lOOmM DTT; 5 шМ ATP (рН 7,8)) ATP 10 т М дефосфорилированную векторную ДНК клонируемый рестрикционный фрагмент ДНК Т4 ДНК лигазу воду 1 мкл 1 мкл 20-60 нг 200-500 нг 2ед. до 10 мкл В реакцию бр

3.9. САУЗЕРН-БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ

Саузерн-блот гибридизацию проводили, как описано у Маниатиса с соавторами [Маниатис и др., 1982]. Готовили 1 % агарозный гель на ТЛЕ буфере (40 мМ трис-ацетат; 2 мМ ЭДТА) с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации в геле 0,1-0,5 мкг/мл. Проводили электрофорез в 1*ТАЕ буфере в течение нескольких часов. После окончания электрофореза помещали на гель полиэтиленовую пленку и зарисовывали расположение лунок и полос маркерной ДНК при облучении жестким ультрафиолетом. Отрезали левый ве

Меченый зонд получали согласно методике, описанной ранее (см. пункт

3.5.3.). Мечение проводили в объеме реакционной смеси 20 мкл.

Гибридизацию проводили согласно методике, описанной ранее (см. пункт

3.5.4.).

3.10. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДВУЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК Секвенирование проводили с использованием Reader^^ DNA Sequencing Kit ("Fermentas").

Для приготовления полиакриламидного геля и гель-электрофореза использовали следующие стоковые растворы: 10*ТВЕ буфер: lOSrTris; 55 г борной кислоты; 9,3rNa2EDTAx2H20; Н2О - до 1 л. 40% раствор акриламида/бисакриламида: 95 г акриламида (перекристализованного из хлороформа); 5 г N, N' метиленбисакриламида; Н2О - до 250 мл. Для приготовления 100 мл 8% полиакриламидного геля с концентрацией мочевины 7 М смешивали: 7,6 г акриламида, 0,4 г бисакриламида (или 20 мл 40% раствора акриламидабисакрила

3.10.2. Секвенирование двуцепочечной ДНК с помощью набора МВ1 Fermentas reader™ DNA sequencing kit Ha одну сиквенсовую реакцию брали 1,5 пмоль плазмидной ДНК (в случае плазмиды, размером 3,0 т.п.н. это составляет около 3,0 мкг). Денатурация плазмидной ДНК. Растворяли 3 мкг суперспиральной плазмидной ДНК в 8 мкл бидистилированной деионизованной воды. Добавляли 2 мкл 2 М NaOH и перемешивали пипетированием. Инкубировали при комнатной температуре 10 минут. Добавляли 3 мкл 3 М раствора ацетата на

4.2. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ОТОБРАННЫХ КЛОНОВ

Для выявления клонов, содержащих полноразмерные копии МДГ4, был проведен Саузерн-блот анализ ДНК, вьщеленной из этих клонов. ДНК рекомбинантных бактериофагов была обработана специфической рестрикционной эндонуклеазой Xhol, поскольку ее сайты содержатся только в ДКП ретротранспозона. Фрагменты, соответствующие полноразмерным копиям, выявляли гибридизацией с меченным Р фрагментом ДНК Hpal-PstI (рис. 9, зонд 2), два содержащим ДКП ретротранспозона. Полноразмерным копиям, имеющим концевых повт

4.2.2. Структурный анализ полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32

2.1. Рестрикционный анализ полноразмерных копий МДГ4 Для определения принадлежности полученных копий МДГ4 к «активному» или «неактивному» подсемействам, был проведен рестрикционный анализ этих клонов с последующей Саузерн-блот гибридизацией. Так как все копии элемента, принадлежащие к «активному» подсемейству, содержат факультативные сайты рестрикции Hindlll (4483), Mlul (5335), Clal (6939) и Xbal (430, 7417) [Lyubomirskaya et al, 1990], их использовали как молекулярные маркеры на выявление

2.2. Секвенирование активности функционально района важного для ретротранспозиционной полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32 Функционально важный для ретротранспозиционной активности МДГ4 участок расположен между сайтами рестрикции PvuII (2733) и Kpnl (3127) (Рис. 5). В этом районе «активная» копия отличается от «неактивной» пятью нуклеотидными заменами, три из которых приводят к двум заменам аминокислот: Thr - Asn (нуклеотид в положении 2928) и Lys - Arg (нуклеотид

3.1. Саузерн-блот анализ отобранных клонов Из 28 клонов, имеющих гомологию с последовательностью МДГ4, только 4 содержали его полноразмерные копии.

а) Г.1

3.1

5.1

6.1

7.1

9.1

10.1

12.1

2.2

3.2

4.2

1.3 40А 12А В2 В8 812 B13 B15 В20 B22 В25 ВЗО В36 т.п.н. т.п.н. 10 10— IZZ. \- Ж 2- mi- Л- б)

1.1

3.1

5.1

6.1

7.1

9.1

10.1

12.1

2.2

3.2

4.2

Для проведения более детального структурного анализа неканонических клонов проводили их рестрикционный анализ. Рекомбинантные вставки переклонировали по сайтам рестрикции ВатШ из фага Х в плазмидный вектор pBluescript II SK (-) ("Fermentas") и обрабатывали специфическими рестрикционными эндонуклеазами Bglll, Clal, EcoRI, Hindlll, Kpnl, PstI, Xbal, и Xi^ol в различных сочетаниях. Рестрикционные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нейлоновый фильтр и гиб

3.3> Идентификация клонированного мобильного элемента Для определения природы клонированного нами мобильного элемента, мы провели частичное секвенирование общей для всех четырех клонов области. Для этого в составе плазмидного вектора pBluescript II SK (-) ("Fermentas") был клонирован фрагмент из клона

3.2. ДНК этого клона обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой Bglll. Рестрикционные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле, вьщеляли фрагмент размером 4,7 т.п.н.

4.3.1. Сравнительный анализ стру1ст7рной организации ретротранспозонов МДГ4 и gtwin Ретротранспозон gtwin, входящий в группу Gypsy ДКП-ретротранспозонов, содержит три ОРС, кодирующие gag, pol и env-подобные белки. Из всех представителей этой многочисленной группы ретроэлементов gtwin наиболее близок хорошо изученному эндогенному ретровирусу МДГ4 (gypsy) D. melanogaster. с помощью доступной в Internet программы BLAST мы сравнили аминокислотные последовательности полипептидов, коди

4.3.2. Исследование структуры третьей открытой рамки считывания ретротранспозонов gtwin, клонированных из линии Г32 При анализе содержащейся в базе данных генома дрозофилы нуклеотидной мобильного элемента gtwin значительной последовательности ретротранспозона gtwin (АС006215 и АС 107326) мы обнаружили, что последовательность гена env элементов прерывается в ее середине стоп-кодоном (позиция 6117-6119 нуклеотидной последовательности gtwin). Мы решили исследовать на наличие терминирующего кодо