Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Механизмы регуляции транспорта Na+ в коже лягушки : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02

Год: 2005

Номер работы: 63370

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

1.2. Влияние ингибиторов нротеинкиназы С на транспорт Na"^ в коже лягушки

4. Роль фосфатидилинозитолкиназ в регуляции транспорта Na^ в коже лягушки

4.2.

2.1. Влияние ингибитора фосфатидилинозитолкиназ вертманнина на транснорт Na"^ в коже лягушки

4.2.

Роль актинового цитоскелета в регуляции фосфатидилинозитолкиназами транснорта Na^ в коже лягушки

4.2.

1. Влияние деполимеризатора микрофиламентов латрункулина В на воздействие вертманнина на транснорт Na^ в коже лягушки

4.2.

2. Влияние стабилизатора микрофиламентов фаллоидина на воздействие вертманнина на транснорт Na"^ в коже лягушки

4. Роль фосфоинозитидной системы в регуляции транспорта Na* в коже головастика

4.2.

3.1. Влияние активатора протеинкиназы С форболового эфира РМА на транснорт Na"*" в коже головастика

4.2.

3.2. Влияние ингибитора фосфатидилинозитолкиназ вертманнина на транспорт Na"^ в коже головастика

4.

Заключение по разделу

4.2.

4.3. Регуляция гормоном инсулином транспорта Na* в коже лягушки

4.3.1. Влияние инсулина на транспорт Na^ в коже лягушки

4.3.2. Роль тирозинкиназ в регуляции инсулином транснорта Na^ в коже лягушки

4.3.3. Роль тирозинфосфатаз в регуляции инсулином транснорта Na^ в коже лягушки

4.3.4. Роль фосфатидилинозитолкиназ в регуляции инсулином транснорта Na* в коже лягушки

4.3.5. Роль протеинкиназы С в регуляции инсулином транспорта Na

2.1. Структурно-функциональная организация системы трансиорта Na* в коже лягушки

Для выяснения механизмов транспорта веществ через биологические мембраны особенно важны эксперименты на тканях и органах, специализированных для транспорта органических и неорганических веществ. К таким органам относится и кожа амфибий. Морфология колш лягушки достаточно сложна, однако, в процессе транспорта воды и ионов она функционирует как целостная система. Эпидермис кожи лягушки {Rana temporaria) представлен многослойным эпителием (рис. 1а). Самая наружная часть эпидермиса включает 1-2 р

2.1.2. Функциональная организация системы транспорта Na^ в гсоже лягушки Существует несколько моделей, описывающих механизм активного транспорта ионов Na"^ эпителиальными клетками (Cereijido, Rotunno, 1968; Krogh, 1938; Guo et al., 2003), однако, в настоящее время общепринятой является двухмембранная модель транспорта Na"^, предложенная Кефед-Джонсеном и Уссингом (Koefoed-Johnsen, Ussing, 1958), и, в дальнейшем, модифицированная Уссингом и Виндхагером (Ussing, Windhager, 1964). Схем

Несмотря на то, что как основные, так и БМ клетки эпителия кожи лягушки способны активно транспортировать ионы Na^, они нредставляют собой разные транснортные единицы, специализированные для выполнения различных функций (см. 18 рис. 2 б, в), и не сообщающиеся друг с другом посредством щелевых контактов (Larsen, 1991). Основные клетки специализированы для осуществления трансэпителиальпого переноса Na"^ и выведения ионов К^. Вероятно, основные клетки не принимают участие в осуществлении

2.1.3. Формирование системы транспорта Na^ в коже лягушки Способность кожи аккумулировать Na^ из окрулеающей среды появляется у амфибий улее на ранних этапах метаморфоза (Taylor, Barker, 1965). Однако на ранних и поздних этапах развития леивотного наблюдаются нринциниально различные по функциям, интенсивности и составу компонентов системы транспорта Na"*". Морфология колеи и локализация в ней основньк Na'^-транснортирующих элементов существенно различается у головастиков и взрослых

2.2.1. Основные иредставители суперсемейства Deg/ENaC Данное суперсемейство объединяет особый тип Na'''-проводящих ионных каналов, блокируемых диуретиком амилоридом. С5шерсемейство амилорид-чувствительных Na каналов обозначается также как Deg/ENaC - суперсемейство (дегенерины/эпителиальные Na^- каналы). Дегенерины/эпителиальные Na^-каналы универсальны для всех многоклеточных животньж (Metazoa) и экспрессируются в различных типах возбудимых и невозбудимых тканей, в которых Deg/ENaC принимают

2.2.2. Структурно-функциональная организация энителиальиых Na -каналов

2.1. Функциональная организация и топология в мембране эпителиальных Na^-каналов Ионный канал типа ENaC образован тремя гомологичными субъединицами, соответственно а-, |3-, и y-ENaC, примерно на 35% совпадающими между собой по составу аминокислот (Canessa et al., 19946). Недавно были клонированы ещё две — 5- и sсубединицы, которые по аминокислотному составу ближе к а-, чем к (3- или усубьединицам ENaC (Kellenberger, Schild, 2002). Субъединицы ENaC содержат от 632 до 698 аминокислотных остатк

2.2. Стехиометрия субъединиц и моделъ поры эпителиальных Na^-каналов Наиболее вероятно, что нативный ENaC представляет собой гетеротетрамер, образованный 2а, lp и 1у гомологичными субъединицами, располагающимися вокруг поры канала, причем две а-субъединицы расцолагаются напротив друг друга (Canessa et al., 1994а; Firsov et al., 1998; Eskandari et al., 1999). Модель тетрамерной организации ENaC представлена на рис. ба. Описана также нонамерная организация ENaC, со стехиометрией субъединиц За;

2.2.3. Биофизические характеристики эпителиальиых Na^-каналов В отличие от нотенциал-зависимых Na^-каналов, активность ENaC не зависит от изменения мембранного потенциала (Benos et al, 1995; Garty, Palmer, 1997). ENaC отличаются высокой селективностью для ионов Na"^ по отношению к ионам К"^ (Benos et al., 1995; Garty, Palmer, 1997; Snyder, 2002). ENaC проницаемы для моновалентных катионов, таких как Na*^, Li^ и Н . Проницаемость ENaC кана1юв для ионов ЬГ немного выше, чем для Na&qu

2.2.4. Регуляция активности эпителиальных Na^-каналов В последние десятилетия молекулярные механизмы, лел<:ащие в основе регуляции активности амилорид-чувствительных эпителиальных Na'''-каналов, являются предметом интенсивных исследований. В настоящее время показано, что в регуляции активности ENaC принимают участие различные системы передачи сигнала в клетке.

4.1. Адепилатциклазная система передачи информации и регуляция активности эпителиальных Na'''-каналов антидиуретическим гормоном В эпителии кожи и мочевого пузыря амфибий и различных сегментах почки позвоночных рецепторы некоторых пептидных гормонов (вазопрессин, паратиреоидный гормон) и катехоламинов (дофамин, эпинефрин) связаны с Gs-белками. Связывание гормона с рецептором приводит к активации аденилатциклазы (АЦ) и увеличению внутриклеточной концентрации циклического аденозинмонофосфата (

Известно, ^ что при участии фосфоинозитидного пути передачи сигнала осуществляется регуляция активности различных компонентов системы транспорта Na"^ в поляризованных клетках. Агонистами рецепторов, стимулирующих гетеротримерные Gq-белки и активирующих ФЛС, являются многие пептидные гормоны, такие как ^ паратиреоидный гормон, ангиотензин II, катехоламин, норэпинефрин, дофамин, влияние которых на активность ENaC показано как для кожи амфибий, так и для многих других реабсорбирующ

В последние годы получены данные, позволяющие рассматривать арахидоновую (эйкозатетраеновую) кислоту и ее продукты (см. рис.

12) в качестве еще одной системы ii вторичных посредников (Bevan, Wood, 1987). Во многих случаях показано, что АК и ее производпые могут взаимодействовать с другими системами передачи информации в ^ клетке, модулируя их сигналы (Axelrod, 1990). Кроме того, АК и ее метаболиты. выделяясь из клеток, могут выстуиать в качестве местных гормонов и медиаторов, активиру

4.4. Тирозинкиназы и тирозинфосфатазы и регуляция активности эпителиальных Na^-каналов инсулином Несмотря на то, что фосфорилирование белков но остаткам тирозина является более редким событием по сравнению с фосфорилированием по остаткам серина или треонина, установлено, что процессы фосфорилирования/дефосфорилирования остатков тирозина являются общим элементом путей внутриклеточной сигнализации, выполняющим важную роль во многих клеточных процессах, таких как пролиферация, рост и дифференц

). Увеличение активности Na'''-помпы приводит к снижению [Na"^]!, которое, в свою очередь, стимулирует ENaC и увеличивает транспорт Na^. Подобный механизм долгое время считался основой стимулирующего эффекта инсулина на транснорт Na* (Rodriguez-Commes et al., 1994). Однако дальнейшие исследования показали, что первичным является увеличение Na'''-проницаемости апикальной мембраны, сопровождающееся снижением сонротивления мембраны и деноляризацией мембранно.го нотенциала (Schoen, Erlij, 1

Цитоскелет играет ведущую роль в таких важнейших нроцессах как секреция, абсорбция, межклеточные взаимодействия и деление клеток. Цитоскелет высших 55 эукариот представлен тремя основными системами филаментов: микрофиламентами (МФ), микротрубочками (МТ) и промежуточными филаментами (ПФ). В связи с многообразием функций, выполияемых эпителиальными клетками, в зависимости от специализации они характеризуются широким разнообразием в организации и компонентном составе элементов цитоскелета. Подо

4.5.1. Роль микротубулярного аппарата клетки в регуляции активности эпителиальных' Быстрое и направленное движение ионных каналов и транспортеров к или от плазматической мембраны, осуществляемое нутем зависимого от МТ везикулярного транспорта, является важным механизмом, обеспечивающим поддержание внутреннего гомеостаза клетки. Противоположно направленное движение везикул вдоль МТ обеспечивается при помощи белков, ассоциированных с МТ — БАМ. Это, в первую очередь, крупные АТФазные комнлексы

4.5.2. Роль элементов актинового цитоскелета в регуляции активности эпителиальных Na''^-каналов Слои ютеток в составе эпителия кожи лягушки (см. раздел

2.1) различаются по степени выраженности актипового цитоскелета: максимальная плотность МФ наблюдается в клетках зернистого слоя, тогда как ниже лежащие слои эпителия характеризуются меньшей плотностью сети МФ (Pratley, McQuillen, 1973; Chou, Els, 1995). В основных клетках зернистого слоя, являющихся главной Na"^- транспортирующей

4.6. Регуляция активности эпителиальных Na'^-каналов альдостероном Минералокортикоид альдостерон является основным гормоном, отвечающим за поддержание водного и солевого баланса у всех наземных позвоночных. В эпителии кожи и мочевого пузыря амфибий, таюке как и в дистальных сегментах почки позвоночных, альдостерон стимулирует (ре)абсорбцию Na"^ и секрецию К"^ (Crabbe, 1961, 1972; Stockand, 2002). Физиологический эффект альдостерона, как и все стероидов, опосредуется экспрессией ге

5.1. Нсевдогиперальдостеронизм (Синдром Лиддла) В 1963 г. Лиддл и соавторы обнаружили редкую форму наследственной гипертонии (Liddle et al., 1963). Синдром Лиддла характеризуется очень высокой скоростью ноступления Na"^ в клетки почки, несмотря на низкий уровень альдостеропа (псевдогиперальдостеронизм). В результате, пациенты страдают от сильной гипертонии, вторичной гипокалиемии и метаболического ацидоза. Заболевание корректируется при тапсплантации почки (Botero-Velez et al., 1994). Д

Псевдогиноальдостеронизм типа 1 (РНА-1) — редкое наследственное заболевание, при котором почка не реагирует на альдостерон (Cheek, Perry, 1957). Характеризуется гинотонией и дегидратацией у новорожденных и детей. У пациентов наблюдается также высокая концентрация ионов К^ в плазме крови и метаболический ацидоз, несмотря на высокий уровень альдостерона. При заболевании поражаются не только почки, но и толстая кищка и потовые железы, в которых происходит иотеря солей. Пациентов обычно лечат

2.3. Na^/K^-АТФаза в базолатеральной мембране кожи лягушки

2.3.1. Структурно-фуикциональиая организация Na^/K^-АТФазы NaVK'''-АТФаза является интегральным мембраным белком, отвечающим за поддержание внутри клетки высокой концентрации К"^ и низкой концентрации Na"^, которые характерны для большинства животных клеток. NaVK^-АТФаза принадлежит к семейству АТФаз Р-типа (Е1Е2-тип), которые отвечают за перенос через клеточную мембрану различных катионов против электрохимического градиента. Данный фермент существует по меньшей мере в двух различн

2.3.2. Гормональная регуляция активностн Na^/K^-АТФазы Активность Na /К -АТФазы в клетках осморегулирующих эпителиальных тканей контролируется широким спектром натриуретических и диуретических гормонов. Причем Иа^К^-АТФаза является мишенью как для быстрого, так и для хронического регуляторного воздействия этих гормонов. Быстрая регуляция Na'''/K'^-АТФазы осуш;ествляется путем модуляции кинетических характеристик фермента или путем встраивания в плазматическую мембрану новых субъединиц Na'

2.1. Регуляция активности NaVK*-АТФазы альдостероном Наравне с ENaC, NaVK^-АТФаза является важным альдостерон-чувствительным эффектором, необходимым для осуществления гормоном регуляции водно-солевого Гормональное воздействне PKG РКС РКА РР2В DARPP-32/ Inhibitor I PPI N. PLA2 АА PP2A % г f t Eicosanoids V уч _ 1 к \ ) лг Изменение активности Na^/B["^-АТФазы *VT Рис. 25. Взаимодействие основных внутриклеточных эффекторов, участвующих в регуляции NaVK'^-АТФазы различными горм

2.2. Регуляция активности Na'''/K'^-АТФазы инсулином Способность инсулина стимулировать активность NaVK^-АТФазы показана для различных типов тканей. Как и альдостерон, инсулин способен оказывать как быстрое, так и хроническое воздействие на активность Na'''/K^-АТФазы. Существует несколысо способов быстрой регуляции инсулином свойств NaVK^-АТФазы, которые схематически представлены на рис. 26. В клетках скелетных мышц, инсулин вызывает быструю транслокацию субъединиц NaVK^-АТФазы из внутрикле

Стимулирующее действие вазопрессина на NaVK^-АТФазу показано для дистальных отделов собирательных трубок почки позвоночньк (Tomita et al., 1987) и клеток Аб (Feraille, Doucet, 2001). Стимулирующее воздействие гормона опосредуется связыванием гормона с V2 рецептором (Coutry et al., 1995) и связано с активацией аденилатциклазы (Carranza et al., 1998). В условиях in vivo и in vitro показано, что вазопрессип вызывает увеличение числа активных субъединиц NaVK'^-АТФазы в базолатеральной мембра

Эксперименты проводили на самцах лягушки Rana temporaria в период с ноября по март и на головастиках того же вида, находившихся на 40 — 54 стадиях метаморфоза (рис. 27). Стадии метаморфоза головастиков Rana teniporaria показаны на рис. 28. Кожу с брюшка взрослых особей срезали и навязывали на полую полиэтиленовую трубку с внутренним диаметром

0.8 см. Кожу с головастиков удаляли целиком и навязывали брюшной частью на идентичную трубку с внутренним диаметром

0.2 см. На поверхность с

В настояш;ее время для измерения трансэпителиального транспорта Na"^ применяют несколько методов. Прямые методы основаны на измерении потоков меченого Na^ и на определении абсолютного количества транспортируемого Na^ с последуюш;им анализом его концентрации в растворе. Однако одним из наиболее адекватных методов измерения транспорта Na"^ является метод короткого замыкания (short - circuit method). Данный метод был предложен в 1951 году Уссингом и Цераном (Ussing, Zerahn, 1951)

3.3. Автоматизированная установка фнксацни нотенциала на коже лягушки Для определения характера действия различных фармакологических агентов на транспорт Na"*" в коже лягушки использовали автоматизированную установку фиксации потенциала. Общая схема автоматизированной установки для фиксации потенциала на коже лягушки представлена на рис. 29.

3.3.1. Установка кожн н электродов Одним из условий адекватного проведения экспериментов с измерением тока короткого замыкания является идентичность солевого состава растворов по обеим сторонам кожи лягушки. В связи с этим, трубку с кожей погружали в раствор Рингера для холоднокровных; таким же раствором заполняли и внутреннюю часть трубки. Использовали две пары хлорсеребряиых электродов: два - для наружного раствора, омывающего апикальную поверхность кожи лягушки {Э22 - раздражающий, Э21 -

3.3.2. Схема фиксации потенциала иа коже лягушки Для регистрации вольт-амперных характеристик кожи лягушки использовали один из наиболее адекватных биофизических методов исследования - метод фиксации потенциала на мембране (voltage - clamp method). Эквивалентная электрическая схема фиксации потенциала на коже лягушки представлена на рис. 30. В установке фиксации потенциала используется двухэлектродная схема задания потенциала на мембране. Схема содержит два дифференциальных усилителя, охваче

3.3.3. Измерение вольт-амперных характернстик коягн лягушки Для измерения вольт-амперных характеристик на кожу подавали лииейноизменяющееся напряжение (ramp) со скоростью 20 мВ/с. В интервалах между измерениями вольт-амперных характеристик трансэпителиальный потенциал (VT) КОЖИ поддерживали при О мВ (режим короткого замыкания) или при потенциале открытой цепи, Voc (Voc = Vj при трансэпителиальном токе 1т - 0). Из вольт-амперных характеристик определяли электрические параметры колш:

с обеих сторон кожи добавляли раствор Рингера для холоднокровных, содержащий (в

мМ): 110 NaCl,

2.5 КС1, 3 СаСЬ, 5 Tris НС1. рН раствора -

7.4. В экспериментах, использовали реактивы фирмы Sigma (США). Маточные растворы РМА (100 мкг/мл), 1-(5-изохинолин сульфонил)-2-метил-пиперазиР1а (Н-7) (50 мМ), хелеритрина (1,5 мМ), генистейна (100 мМ), фаллоидина (10 мМ), таксола (25 мМ), дигидроцитохалазина В (10 мМ), цитохалазина В (4 мг/мл), латрункулина В (5

мМ) и вертманн

4.1. Роль цитоскелета в регуляции транспорта Na^ в коже лягушки

4.1.1. Влияние агентов, вызывающих реорганизацию микротрубочек, на транснорт Na в коже лягушки Для исследования возможной роли микротрубочек (МТ) в регуляции транспорта Na"^ в коже лягушки мы использовали два различных типа тубулин-связывающих агентов: агенты, стимулирующие деполимеризацию МТ (колхицин, колцемид, + винбластпи), и МТ-стабилизирующий агент (таксол).

1.1. Влияние агентов, вызывающих деполимеризацию микротрубочек, на транспорт Na"*" в коже лягушки Известно, что алкалоиды безвременника осеннего (Colchicum autumnale) колхицин и колцемид индуцируют деполимеризацию МТ путем образования эквимолярного комплекса с молекулами свободного р-тубулина, взаимодействие которого с полярными концами МТ препятствует как росту, так и разборке МТ (Bergen, Borisy, 1983; Mitchison, Kirschner, 1984). Колхицнн и колцемид связываются с одним и тем же у

1.2. Влияние агентов, вызывающих стабилизацию микротрубочек, па транспорт коже лягушки В отличие от других антимитотичеких агентов, таких как колхицин, колцемид, нокодазол, винбластин или винкристин, таксол, выделяемый из Taxus brevifolia, вызывает стабилизацию полимерных МТ (Kumar, 1981; Dumontet, Sikic, 1999). Отличительной особенностью таксола является также то, что он практически не взаимодействует со свободным тубулином вне МТ (Parness, Horwitz, 1981). Участок связывания таксола распо

4.1.2. Влияние агентов, вызывающих реорганизацию микрофнламентов, на траисиорт Na^ в коже лягушки Для исследования роли актинового цитоскелета в регуляции транспорта Na"*" в коже лягушки мы использовали два тина фармакологических агентов: вызываюш;их стабилизацию (фаллоидин) (Cooper, 1987) или подавление (цитохалазин В, дигидроцитохалазин В и латрункулин

В) (Coue et al., 1987; Spector et al., 1989) полимеризации актиновых филаментов.

2.1. Влияние агентов, вызываюп],их деполимеризацию микрофиламентов, на транспорт Na* в коже лягушки Цитохалазины (ЦХ) - семейство метаболитов, выделяемых плесневых грибов, подавляют многие формы подвижности из различных включая клеток, локомоцию, фагоцитоз, цитокинез, образование ламеллоподий и микрошипов и сворачивание эпителиальных пластов в трубки. В то же время, ЦХ не оказывают влияния на стабильные МФ, быстро растуш;ие плюс-концы которьгх «кэпированы» актинсвязываюш;ими белками. Связ

Фаллоидин, высокотоксичный алкалоид бледной поганки Amanita phalloides, в отличие от ЦХ и латрункулинов, стабилизирует актиновые филаменты, подавляя их деполимеризацию (Фултон, 1987; Cooper, 1987). Таюке как и таксаны, фаллоидин связывается с нолимерным F-актином стехиометрически (Фултон, 1987; Cooper, 1987). Благодаря отличительной способности фаллондина специфически связываться именью с нитями актина, его флуоресцентные производные часто иснользуют вместо антител к актину для выявления лока

3.

Заключение по разделу

4.1. Известно, что разрушение микротрубочек приводит к подавлению стимулируюш:его влияпия гормонов на транснорт Na"*" или предотвращению развития адантивных реакций в клетках осморегулируюш;их энителиев (Parisi et al., 1985; Parczyk et al., 1989; Verrey et al, 1995; Мафкэ et al., 1996). Литературные данные о влиянии микротрубочек на транспорт Na^ очень противоречивы. Суш;ествуют работы, в которых показано, что изменение структуры микроту

4.2. Роль фосфоинозитидной системы в регуляции транспорта Na^ в коже лягушки

4.2.1. Роль протеиикииазы С в регуляции трансиорта Na^ в коже лягушки Протеинкиназа С (ПКС) является одним из важнейших модуляторов функций любой эукариотической клетки. Известно, что с участием ПКС осуществляется регуляция широкого спектра функций эпителиальных клеток почки и ряда других реабсорбирующих эпителиев, в том числе, модуляция водного и Na"^ транспорта через эпителий почки (Nishizuka, 1995; Els et al., 1998) и транспорта Na"^ в коже и мочевом пузыре лягушки (Civan et al.