Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Фотодинамическое повреждение нервных и глиальных клеток: механизмы клеточной смерти и нейроглиальные взаимодействия : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02

Год: 2005

Номер работы: 63367

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Фотодинамический (ФД) эффект заключается в повреждении клеток, окрашенных фотосенсибилизаторами (ФС) - акцепторами излучения, действием света. Впервые ФД эффект наблюдал в 1900 году под О. Рааб, обнаружив зависимый от освещения токсический эффект производных акридина на простейшие. В 1904 году Von Tappeiner и Jodblauer обнаружили, что для фотодинамического повреждения клеток необходим кислород (Daniel, Hill, 1991). Таким образом, для ФД повреждения клеток необходима триада: "краситель

Фотодинамическое воздействие, генерируя различные цитотоксические АФК, может вызывать гибель клеток, как в результате развития некроза, так и апоптоза (Не, Oleinick, 1994). Эти два основных типа клеточной гибели были дифференцированы в 70х годах (Kerr, 1971; Kerr et al., 1972; Willie et al., 1980). Они различаются как инициирующими факторами, так и морфобиохимическими изменениями, происходящими при клеточном коллапсе (Новиков, 1996). Смерть интенсивного некротического типа, как правило, являе

Фотодинамический эффект успешно используется для разрушения опухолевой ткани в онкологии. В основе метода фотодинамической терапии (ФДТ) рака, разработанного Т. Догерти (Dougherty et al., 1975, 1978), лежит тот факт, что после введения в организм некоторые нетоксичные красителифотосенсибилизаторы селективно накапливаются в опухолевой ткани. При последующем лазерном облучении опухоли фотовозбужденные молекулы фотосенсибилизатора генерируют синглетный кислород 'Ог и другие цитотоксические про

При ФДТ воздействию могут подвергаться не только опухолевые, но и нормальные клетки, в том числе элементы нервной системы - нейроны и окружающие их глиальные клетки. Поэтому важно изучать особенности реакций этих клеток на ФД воздействие. Отдельные стороны реакций нейронов на ФД воздействие довольно хорошо изучены (Pooler, 1972; Pooler, Valenzeno, 1979; Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al., 1992, Uzdensky, 1996, 1997; Uzdensky, Mironov, 1999; Uzdensky et al., 2000, 2001, 2002; Bragin et al., 20

Глиальные дифференцированы. функциональных клетки В центральной ЦНС на нервной системы сильно и основании 3 морфологических ГК: признаков различают типа астроциты, составляют них олигодендроциты и микроглиоциты (Рис.

1.2). Астроциты приблизительно 40-50% популяции всех глиальных клеток. Для характерно наличие большого количества отростков, которые лучеобразно отходят от клеточного тела (Немечек и др., 1978). Такие отростки называются главными. Расположенные на поверхностях гл

В периферической нервной системе (ПНС), в отличие от ЦНС, глиальные клетки менее дифференцированы. Единым глиальным элементом в ПНС являются шванновские клетки, которые образуют оболочки периферических нервных волокон и окружают терминали мотонейронов (Немечек и др., 1978; Николлс и др., 2003). В области периферических ганглиев, где шванновская глия окружают тела нейронов, она принимает более "эпителоидную" форму в виде сателлитных клеток. Эти клетки не экспрессируют миелинового бел

В основных типах межклеточной сигнализации участвуют рецепторы, связанные с G-белками и рецепторные тирозинкиназы. В первом случае, при связывании лиганда с рецептором активируется аденилатциклазныи, втором случае тирозинкиназный сигнальный путь.

1.3.1 Аденилатциклазныи путь Многие трансмембранные рецепторы водорастворимых а во гормонов функционально связаны с аденилатциклазой (Рис.

1.3). Взаимодействие рецепторов с аденилатциклазой осуществляется не напрямую, а посредством G-белков, состоящих из трех субъединиц: а, (3 и у. Связывание лиганда с рецептором, изменяет конформацию последнего, и позволяет ему связаться с G-белком. Это приводит к активации специфического G-белка путем замены присоединенного к его а-субъединице ГТФ

Объектом исследования служил изолированный мышечный рецепторный орган (МРО) речного рака Astacus leptodactilus. Он состоит из двух рецепторных мышц, двух механорецепторных нейронов и окружающих нейроны клеток глиальной оболочки (Рис.

2.1а). МРО расположены у дорсальной поверхности разгибательных мышц брюшка речного рака, симметрично, по одному с каждой стороны тела. При сгибании брюшка происходит растяжение рецепторных мышц, вследствие чего мембраны дендритных окончаний, разветвляю

Механорецептор речного рака выделяли под контролем бинокулярного микроскопа по методике Wiersma et al. (1953). Рецепторные мышцы вырезали вместе с кусочками сегментов хитинового панциря к которым ванночку они прикреплены. Отпрепарированный раствора МРО ван переносили в для с 2 мл физиологического Харревельда холоднокровных животных (шМ: NaCl - 205; КС1 -

5.4; ЫаНСОз -

0.24; MgCb -

5.4; СаСЬ -

13.5; рН

7.2-

7.4). Кусочки панциря насаживали на иглы,

Для исследования ФД эффекта, инициируемого в нейронах и ГК фотосенсибилизированными реакциями преимущественно 1-го или 2-типа, в качестве фотосенсибилизаторов использовали рибофлавин (Reanal, Венгрия) или Фотосенс (НИОПИК, Москва), соответственно. Известно, что рибофлавин (Рис.

2.3), генерирующий при освещении в основном супероксиданион радикалы, является фотосенсибилизатором 1-го типа (Girotti, 1990; Schmidt, Butler, 1976; Schmidt, 1984). Тогда как Фотосенс относится к Рис.

2.3 С

Через 30 минут после контрольной регистрации генерируемых нейроном, в экспериментальную частоты ПД, ванночку добавляли Фотосенс или рибофлавин. В большинстве опытов после 30-минутной инкубации с фотосенсибилизатором изолированный механорецептор подвергали общему ФД воздействию, облучая тело нейрона вместе с дендритами, частью аксона и рецепторных мышц. Диаметр луча He-Ne лазера, используемого для индукции ФД действия Фотосенса, составлял 4 мм. Диаметр светового пятна в плоскости препара

Для исследования роли импульсной активности нейрона в выживаемости ГК изолированного МРО, рецепторные нейроны после установки в экспериментальную ванночку приводили в состояние покоя, сокращая рецепторные мышцы и лишая тем самым механорецепторы адекватной стимуляции. Эксперимент продолжался 6 или 12 часов. В течение этого времени нейроны в контрольных препаратах, медленно адаптируясь, продолжали генерировать ПД с начальной частотой около 10 Гц. В другой серии экспериментов изучали р

Взаимодействия между нейронами и ГК могут осуществляться посредством обмена различными молекулярными сигналами (Coles, Abott, 1996; Kury et al., 2001). С целью изучения роли аденилатциклазной и тирозинкиназной сигнальных систем в реакции нейронов и ГК на ФД воздействие мы использовали фармакологические модуляторы активности ключевых ферментов этих сигнальных путей. Концентрации модуляторов подбирались таким образом, чтобы эти вещества не оказывали влияния на импульсную активность нейро

Для исследования локализации фотосенсибилизаторов в препарате изолированного флуоресцентной механорецептора микроскопии применяли метод прижизненной инкубации с (Майоров, 1978). После фотосенсибилизатором препарат отмывали физиологическим раствором ван Харревельда и фотографировали в проходящем свете и в свете люминесценции на микроскопе ЛЮМАМ И-3 (ЛОМО, Ленинград) оснащенном водно-иммерсионным объективом 60^ (ЛОМО, Ленинград) и цифровой камерой Nikon Coolpix 995 (Nikon Corp., Япония). Для фо

светом ртутной лампы высокого давления ДРШ-250-3 со светофильтром УФС 6-3 Определение типов ФД-индуцированной гибели нервных и глиальных клеток (некроз и апоптоз) осуществляли с помощью морфологических критериев. По присущему некрозу повреждению плазматической мембраны и характерной для апоптоза фрагментации ядра (Новиков, 1996). Для выявления этих признаков в динамике препараты через 1, 4 или 8 часов после воздействия последовательно окрашивали 20 микромолярными растворами двух флуорохромов

Спектр поглош;ения Фотосенса в растворе ван Харревельда, использовавшегося в наших опытах, имел максимумы 350, 605 и 674 нм (Рис.

3.1а), а спектр поглощения рибофлавина - 368 и 442 нм (Рис.

3.16). В наших экспериментах для ФД воздействия Фотосенса и рибофлавина мы использовали источники излучения со спектральными максимумами 633 и 490 нм, соответственно. Экстинкции сенсибилизаторов на этих длинах волн составляли примерно 20 и 60 % от максимального поглощения (Табл.

3.

3.2. Локализация фотосенсибилизаторов в изолированном механорецепторе Поскольку генерируемый при ФД воздействии, цитотоксический синглетный кислород диффундирует за время жизни на расстояние не более 10-20 нм 300 500 700 400 600 а Длина волны, им Длина волны, им Рис.

3.1 Спектры поглощения (а) Фотосенса, и (б) рибофлавина в растворе ван Харревельда. Таблица

3.1 Коэффициенты молярной экстинкции Фотосенса и рибофлавина Фотосенс ^тах? НМ Рибофлавин ^^-тах, НМ л/моль* см 0,76-1

ФД действие Фотосенса в концентрации 10"^ М в большинстве опытов (63 %) вызывало учащение импульсации МРН, приводящее затем к резкому необратимому прекращению генерации ПД (реакции В-типа, Рис.

3.7а). Такие реакции могли быть результатом повреждений плазматической мембраны, ее деполяризации и развивающегося деполяризационного блока (Uzdensky et al., 2002). О повреждении ПМ нейрона и развитии некроза в ходе такого интенсивного ФД воздействия свидетельствовала наблюдаемая сразу же по

ФД воздействие Фотосенса (10" М) вызывало гибель глиальных клеток, как в результате некроза, так и апоптоза. Это проявлялось в увеличении процента ГК с поврежденной ПМ и ядрами, флуорохромированными пропидиум-иодидом - некроз (Рис.

3.10), и в увеличении количества глиальных клеток с фрагментированными ядрами апоптоз (Рис.

3.12). Достоверное увеличение процента некротических ГК наблюдалось уже через час после облучения препарата (Рис.

3.11). Далее, в "темновых&qu

Выраженное фотодинамическое действие рибофлавина на импульсацию МРН наблюдалось при концентрациях 10'^ М и более. При ФД воздействии 10"^ М рибофлавина импульсная активность нейрона прекращалась за 120 минут, а при концентрации Ю"'* М - за 37 минут. Инактивация нейрона происходила в результате постепенного уменьшения частоты импульсации вплоть до полного прекращения импульсной активности (Рис.

3.16 а). Такая тормозная реакция могла быть опосредована МРН Са^^, выходящим активац

Через 1 час после ФД воздействия рибофлавина (10"

М) наблюдалось повреждение цитоплазматической мембраны и некроз примерно половины глиальных клеток. В течение последующих 4 часов процент некротических ГК оставался неизменным (Рис.

3.17 в, Табл.

3.2). В отличие от некроза, количество апоптозных ГК с фрагментированными ядрами достоверно возрастало в пять раз через 4 часа после ФД воздействия (Рис.

3.17г, Табл.

3.2). Таким образом, экзогенный рибофлавин способ

Для изучения роли нейрона в реакции ГК на ФД воздействие мы перед общим облучением (633 нм, 0,3 Вт/см ) окрашенного Фотосенсом (10'

М) препарата избирательно инактивировали нейрон, облучая его тело сфокусированным лазерным лучом. В одной серии экспериментов для избирательной ФД инактивации нейрона использовали излучение He-Ne лазера (633 нм, 200 Вт/см^), а в другой серии - менее интенсивное излучение полупроводникового лазера (650 нм, 50 Вт/см ).

3.5.1. Инактивация нейрона локальным интенсивным ФД воздействием Локальное лазерное облучение МРН, инкубированного 30 минут с 10' М Фотосенса, вызывало резкое увеличение частоты импульсации (до 5070

Гц) с последующим необратимым срывом генерации ПД (Рис.

3.18). Подобная возбудительная реакция, по-видимому, была следствием повреждения ПМ, деполяризации и деполяризационного блока (Uzdensky et al., 2002). Среднее время жизни нейронов облученных He-Ne лазером •у (633 нм, 200 Вт/смО

Локальное ФД воздействие на тело нейрона вызывало также некроз попадавших в зону облучения окружающих глиальных клеток. Диаметр "зоны некроза" ГК был больше диаметра сфокусированного лазерного луча и составлял в случае He-Ne и полупроводникового лазера 200 и 100 мкм, соответственно (Рис.

3.19 б, в). Это могло объясняться тем, что отростки глиальных клеток, окружающих тело МРН, занимают площадь значительно большую, чем область, занимаемая их ядрами. ФД повреждение плазматическо

В последнее время накапливаются данные о том, что импульсная активность нейрона может оказывать влияние на сигнальные процессы в глиальных клетках (Dani et al., 1992; Barres, Raff, 1993; Fields, StevensGraham, 2002). В наших экспериментах (п.

3.5.2.) локальное ФД повреждение нейрона, инактивировало его способность генерировать импульсы и усиливало ФД-индуцированный апоптоз ГК. Можно предположить, что выживаемость окружающих МРН глиальных клеток зависит от импульсной активности нейрона.

Для изучения роли функциональной активности нейрона в выживаемости глиальных клеток изолированного МРО мы сравнивали некроз и апоптоз ГК в механорецепторах, находящихся в состоянии покоя или в состоянии умеренного возбуждения, когда нейрон работал с частотой около 10 Гц в течение 6 или 12 часов. Оказалось, что умеренная стационарная импульсация изолированного механорецепторного нейрона в течение 6 или 12 часов не влияет на выживаемость окружающих глиальных клеток: уровни некроза и апоп

Для изучения роли нейронной активности в выживаемости ГК после ФД воздействия, мы блокировали импульсацию нейрона местным анестетиком лидокаином, а затем, после инкубации с Фотосенсом (10"^ М), подвергали весь препарат 30-минутному ФД воздействию. В контрольных препаратах нейроны продолжали генерировать ПД в ходе ФД воздействия, которое продолжалось столько же времени, что и в опыте. При действии 0,2-0,4 % раствора лидокаина в темноте импульсная активность нефотосенсибилизированного нейр

Избирательная инактивация нейрона усиливала ФД-индуцированный апоптоз ГК, окружающих проксимальный участок аксона. (Колосов, 2004). То есть, нейрон защищал окружающие глиальные клетки от фотоиндуцированного апоптоза. Такое влияние могло быть связано с выделением нейроном трофических факторов, распознаваемых глиальными клетками. Такими факторами могут быть нейрегулины - факторы роста глии (Корр et al., 1997). Известно, что факторы роста распознаются рецепторными тирозинкиназами (РТК) и иниции

Для изучения роли аденилатциклазного сигнального пути в реакциях МРН и ГК на ФД воздействие мы использовали ингибитор аденилатциклазы MDL-12330A (Guellaen et al., 1977) или ее активатор форсколин (Seamon et 86 al., 1981). Концентрации этих веществ были подобраны так, чтобы в темноте они не влияли на импульсную активность нейрона в течение 2-3 часов. В темноте MDL-12330A и форсколин постепенно тормозили импульсную активность МРН вплоть до ее полного прекращения в среднем через 3,5 и 5,5 часов