Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Изменение состава липидов эритроцитов голубя при индуцированном апоптозе : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02

Год: 2005

Номер работы: 63351

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

ГЛАВА 1. Молекулярные механнзмы и биологическая роль апоптоза

1.1. Общие понятия и характеристика аиоитоза Апоптоз, или программируемая гибель клеток, представляет собой управляемый процесс самоуничтожения клеток. Он направлен на освобождение от старых или наработанных в избытке клеток, а так же от клеток с нарушением дифференцировки и повреждении вещества. Обновление форменных элементов крови, в генетического том числе, эритроцитов происходит весьма интенсивно и может запускаться также через изменение химического состава клетки - качественного и коли

1.2 Молекулярные механизмы лежащие в основе анонтоза Эритроциты млекопитающих образуются из плюрипотентных стволовых клеток в желточном мещке эмбриона, в печени и селезенке, в красном костном мозге плоских костей в постнатальный период развития организма. Эритропоэз в красном костном мозге, регулируемый гликопротеиновым гормоном эритропоэтином, включает ряд промежуточных стадий (И.А. Кассирский, 1955). Эритробласты, лищенные эритропоэтина, погибают в результате апоптоза (Р.А. Gregoli et al

ГЛАВА 2. Объект и методы исследования

2.1. Объект исследоваиия и постаиовка оиыта Объектом исследования служили эритроциты крови голубя (Columba livia). Для исследования использовали эритроциты цельной крови, отмытые физиологическим раствором. Кровь стабилизировали раствором цитрата натрия 3,8% ( 9 : 1 ) или раствором гепарина 0,15 мг (5000ед в 1

мл) на 1 мл крови. В качестве ингибитора каталазной и пероксидазной активности использовали I мМ раствор цианистого калия в физиологическом растворе (R. Pufalt et al.,1995). Инкуб

2.2. Микроскопия эритроиитов голубя Морфологические характеристики эритроцитов исследовали при помощи микроскопа «Люмам Р8» с компьютерной регистрацией данных (рис.

2.1). Для приготовления мазков на чистое предметное стекло наносили небольшую каплю крови, с помощью отщлифованного стекла готовили мазок. Окраску проводили Эозином метиленовой сини. Краситель Эозина метиленового синего представляет собой 0,25% раствор сухого красителя, являющегося смесью азура с метиленовым голубым в соо

2.3. Выделение фосфолипазы Аг из эритроцитов Для исследования использовали кровь взятую в соотношении 9 : 1 с 3,8 % раствором цитрата натрия. Для получения эритроцитарной массы эритроциты трижды промывали физиологическим раствором с последуюшим центрифугироваршем эритроцитов в течение 15 мин нри 2000 к ним об/мин. Гемолиз проводили добавлением равного количества дистиллированной воды. К 0,4 мл гемолизата добавляли 0,2 мл 2М раствора 42 хлорида натрия и перемешивали в течение 10 мин при

2.4. Определение активности фосфолиназы Аг Активность ФЛАг определяли по накоплению лизофосфатидилхолииа в реакции с фосфатидилхолином методом ТСХ. В качестве субстрата использовали фосфатидилхолин, очищенный хроматографическим методом. Идентификацию ФХ проводили после выдерживания пластины в парах йода сопоставлением значений Rf с данными литературы. После чего пятна фосфолипида соскабливали в пробирку с притёртой пробкой, заливали смесью хлороформ : метанол (2 :

1) и оставляли на экс

2.5. Количественное определение белка в ферментном препарате Определение белка проводили по методу Лоури (О.Н. Lowry et al., 1951). Исследуемый раствор в количестве 50мкл смешивали с 2 мл реактива 3, оставляли при комнатной температуре па 10 минут. Затем добавляли 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивали и оставляли на 1 час. После чего колориметр ировали при 750 нм против контроля на спектрофотометре СФ46.

2.6. Определеппе содержапия ТБК-актпвпых вещеетв (малонового диальдегида) в эритроцитах Метод основан на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии МДА с тиобарбитуровой кислотой. Для исследования отбирали 0,1 мл эритроцитов, трижды отмытых изотоническим раствором и гемолизировали внесением в пробирку 2,0 мл дистиллированной воды. К полученному гемолизату добавляли 1,0 мл раствора ТХУ(170 г/л) и 1,0 мл 44 раствора ТБК. Пробу прогревали в кипящей водяной бане в течение 10 минут, з

2.7. Оределение содержания диеновых конъюгатов Метод основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в крови по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра (233 нм). К 0,4 мл эритроцитов, отмытых трижды охлажденным изотоническим раствором, добавляли 1 мл хлороформа, 2 мл метанола и 0,4 мл дистиллированной воды. Все это тщательно перемешивали и помещали в холодильник на 1 час. Затем добавляли 2 мл хлороформа и пробу цен

2.8. Получение сфингомиелина Для упрощения выделения сфингомиелина из общих липидов головного мозга КРС применяли метод осаждения ацетоном (М. Кейтс и др., 1975). Это самый простой и часто самый эффективный метод отделения фосфолипидов от нейтральных липидов и пигментов. Большинство фосфолипидов не растворяется в холодном ацетоне, в то время как глицериды и другие нейтральные липиды хорощо растворяются в ацетоне даже на холоде. Аликвотную часть раствора липидов (100

мг) помещали в цент

2.9. Полученне диацнлглнцерола Для получения диацилглицерола использовали ферментативную реакцию фосфолипазы С с фосфатидилхолином. Для этого 100 мг яичного лецитина растворяли в 6 мл диэтилового эфира, добавляли в раствор 1,2 мг фосфолипазы С в 3 мл

0.001 М раствора СаСЬ и 1 мл 0,1 М трис-буфера (рН 7,3). Смесь встряхивали в течение 1 ч при 27°, охлаждали до комнатной температуры и переносили в делительную воронку объемом 20 мл. После разделения фаз водный слой экстрагировали диэтилов

2.10. Получение суспензий сфингомиелина, фосфатидилсерина и диацилглицерола После проверки и чистоты полученных фракций получали сфингомиелина, суспензии в фосфатидилсерина диацилглицерола, физиологическом растворе на ультразвуковом диспергаторе UM-4 в течение 10-20 минут до получения опалесцирующего раствора.

2.11. Хроматографические методы аиализа

2.11.1. Тонкослойная хроматография лниидов

1.1. Подготовка силикагеля и ириготовлеиие иластииок Подготовка силикагеля и приготовление пластинок для препаративного разделения липидов методом ТСХ применяли силикагель марки КСК Воскресенского химкомбината и Kieselgel 60 gipshalting фирмы «МегЬ> (Германия). При работе с КСК силикагель с необходимыми размерами частиц, пригодный для ТСХ получали следующим образом. Гранулы размалывали на щаровой мельнице 24 часа, затем переносили порощок в 3-х литровую емкость с дистиллированной водой, п

1.2. Разделение липидов Для разделения липидов использовали прямоугольные выстилали хроматографические камеры (25x20x5 см). Стенки камеры изнутри фильтровальной бумагой, чтобы ускорить ее насыщение парами системы растворителей. Если атмосфера внутри камеры была не насыщена и растворитель испарялся из слоя адсорбента в процессе восходящей хроматографии, наблюдали ухудшение разделения. Систему растворителей в камере готовили по крайней мере за 1 час до проведения хроматографии, заливая в не

1.3. Разделение общих липидов Для разделения иснользовали систему Роузера (Rouser G. et al.,1970). В первом направлении применяли аммиак (65: 25: систему 5, по объему), растворителей во втором- хлороформ:метапол:25% хлороформ:метанол:ацетон:уксусная кислота:вода (62,5: 12,5: 25:12,5: 6,25, по объему). Перед нанесением и разделением пластинки промывали в первой системе без липидов. Липиды в количестве 1-2 мг наносили микрошприцем «namilton» (США) в виде точки на расстоянии 1,5 см от нижнего

1.4. Обнаружение липидов при помощи йода Для обнаружения липидов использовали метод, оспованный на быстроте, окрашивание их парами йода, он удобен благодаря своей универсальности и отсутствию разрушающего действия на липиды. Пластины по извлечения из хроматографической камеры высушивали и помешали в эксикатор, содержащий кристаллы йода. Эксикатор с йодом подготавливали заранее и держали в теплом месте для заполнения его парами йода. Окрашивание длилось от нескольких минут до нескольких час

1.5. Обнаружение фоефолинндов Обнаружение разделенных фосфолипидов проводили, используя универсальный реактив для анализа фосфора в липидах (V.E. Vaskovsky et al, 1975). Сначала получали исходный реагент А. К 10 г натрия молибденовокислого в 60 мл 4н ПС1 добавляли 0,4 г солянокислого гидразина в 14 мл 4н НС1. Смесь нагревали на водяной бане в течение 20 мин, охлаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Используемый для количе

1.6. Определение микроколичеств фосфора лииидов Для определения количества индивидуальных фосфолинидов соскабливали с пластинки пятно каждого фосфолинида в стеклянную нробирку. Затем добавляли в каждую пробирку по 0,062мл 72% хлорной кислоты. Помешали пробирки в дюралевый блок и сжигали при температуре 180-190''С в течение 50 минут. Давали пробам остыть, и добавляли по 0,45 мл универсального реагента Васьковского (реагент В). Пробы тшательно неремешивали на резиновом блоке шейкера, после че

2.12. Газожидкостнаявая хроматография. Анализ жирных кнслот

2.12.1. Метилирование жирных кислот Метилирование проводили с помощью раствора трехфтористого бора в метаноле, что позволяет сократить время метилирования до 30-90 мин. В ампулу отмеряли небольшой объем (1

мл) раствора липидов в хлороформно - метанольной смеси (2 : 1 по объему), содержащей 5-10 мг липидов. Растворитель упаривали в токе азота и к сухому остатку липидов приливали 1 - 1,5 мл раствора трехфтористого бора в метаноле. Ампулы запаивали и помещали в термостат с температурой 100

2.12.2. Техника хроматографического анализа жирных кислот Разделение веществ методом ГЖХ осуществляли на газовом хроматографе CHROM — 5. Колонку, помещенную в термостат, заполняли инертным носителем \Т, (измельченным твердым веществом), на который нанесен тонкий слой нелетучей жидкости (жидкая фаза). Смесь, подлежащую разделению, вводил в специальную камеру, находящуюся в начале колонки, где она быстро испаряется и уносится в колонку потоком газа-носителя из баллона, проходящего через редук

2.12.3. Обработка результатов хроматографических исследований Результаты исследований иолучали в виде хроматограмм с рядом пиков различной высоты и ширины, каждый из которых соответствовал индивидуальной жирной кислоте. Количественный анализ нолученных хроматограмм нроводили в соответствии с онисанными в литературе методами (Литвинов и др., 1971; Коган и др., 1975; Вигдергауз и др., 1977; Пецев и др., 1987). Метод внутреннего стандарта Метод основан на сравнении илощадей ников известного ве

Все результаты подвергали статистической обработке с использованием IBM 1Р2 - электронных таблиц Microsoft Excel 2000 и пакета программ STAT2.

ГЛАВА 3. Выброс клеточного ядра из эритроцитов голубя и состояние мембранных лннндов нрн воздействии нероксндом водорода и УФ-облучением

3.1. Пероксид водорода как индуктор аионтоза эритроцитов голубя. Влияние темнературы При опасных для жизнедеятельности повреждениях, исчерпании ресурсов, а также ряда других факторов, для исключения лизиса (некроза), приводящего к воспалению тканей, инициируются процессы аутофагии и апоптоза. Мощными повреждающими факторами, индуцирующими апоптоз, являются активные формы кислорода (В.П. Скулачев и др., 2001). В нормальных условиях антиоксидантная система клетки справляется с происходит о

3.2. Индукция апоптоза эритроцитов голубя УФ-излученим. Влияние темиературы Известно, что УФ-излучение является одним из факторов, вызывающих программируемую гибель клеток (B.C. Новикова и др., 1996). Под воздействием УФ света происходит образование АФК, накопление которых может индуцировать апоптоз клеток, молекулярный механизм данного явления до настоящего времени не изучен. В связи с этим, представляло интересным изучить механизм активации апоптоза УФ-излучением эритроцитов голубя. В хо

4.2. Влияние добавлениого фосфатидилсерииа и диацилглииерола как индукторов аионтоза эрнтроиитов голубя Нарушение нормальной их баланса в клетках несовместимость или их с дальнейшей его жизнедеятельностью неснособностью восстановить нриводит к заиуску нроцессов апоптоза. Веш;ества - индукторы аиоптоза могут быть различной природы. Выше нами было ноказано, что в качестве индукторов аноптоза могут выступать нероксид водорода, УФоблучение и сфингомиелин. В последние время в литературе