Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Синтетические пятитяжевые α-суперспиральные фибриллы: конструирование и свойства : диссертация ... кандидата физико-математических наук : 03.00.02

Год: 2005

Номер работы: 63349

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

4.2.1. Исследование вторичной структуры oFFP и oFFPcc методом спектроскопии кругового дихроизма (КД). комплексов, формируемых пептидами oFFP и oFFPcc.

4.2.3. Исследование стабильности а-суперспиральных фибрилл, формируемых пептидом aFFP. aFFP, методом малоугловой дифракции рентгеновских лучей.

4.3. Конструирование и экспериментальное исследование структуры полипептида, несущего на N-конце последовательность, нарушающую характерную для а-суперспиралей квазипериодичность.

4.3.

5.2. Экспериментальное исследование структур, образованных пептидами

5.2.1. Исследование вторичной структуры oFFP-l, aFFP-2 и aFFP-3 а-суперспиральных комплексов, формируемых пептидами aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-3.

5.2.

2.1. Исследования методом электронной микроскопии.

5.2.

2.2. Исследования гидродинамическими методами.

5.2.3. Исследование стабильности а-суперспиральных фибрилл, формируемых пептидами aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-3. aFFP-2rgd и aFFP-3rgd.

5.4. О

а-Суперспирали (a-helical coiled coil), состоящие из одиночных а-спиралей, закрученных одна вокруг другой, впервые были описаны Полингом, Кори и Криком в 1953 году как основной структурный элемент большого класса фибриллярных белков, таких как кератин, миозин и фибриноген (Pauling & Corey, 1953; Crick, 1953). На сегодняшний день известно более 200 различных белков, содержащих а-суперспиральные домены, как важный структурный мотив (например, Lupas, 1996). Структуры многих из них определены

Рисунок 1. Геометрические параметры двухтяжевой а-суперспирали: А - шаг а-суперспирали; а - угол, который образует каждая а-спираль относительно оси суперспирали; Р - угол между двумя соседними а-спиралями а-Суперспирали - это пучок а-спиралей, которые закручены в суперспираль (рис.1). Расстояние, которое требуется а-суперспирали, чтобы совершить полный оборот вокруг оси, называется шагом а-суперспирали (А на рис.1). Также для описания данного структурного элемента используют следующие парам

2.3. Принципы олигомеризации а-спиралей в а-суперспиральные комплексы.

23.1. Стехиометрия а-суперспиралей. В лаборатории Олбера исследовали стехиометрию и упаковку гидрофобных многочисленных аминокислотных мутантных остатков форм в межспиральной зоне двухтяжевой параллельной а-суперспирали фрагмента активатора транскрипции дрожжей GCN4, состоящего из 33 аминокислотных остатков (НагЬшу, et al., 1993). В этих экспериментах исследовались мутанты GCN4, в которых остатки в положениях (а) и (d) были систематично заменены другими различными гидрофобными остатками прит

2.3.3. Гомоили гетероолигомеризация а-спиралей. а-Суперспиральные комплексы могут образовываться из идентичных полипептидных цепей (гомоолигомеризация) или из разных полипептидных цепей (гетероолигомеризация). комплексов Большая часть описанных выше а-суперспиральных представляет собой гомоолигомеры. Классическим примером гетеродимера является параллельная двухтяжевая а-суперспираль Fos-Jun из фактора транскрипции bZIP (O'Shea, et al., 1989; Glover & Harrison, 1995). Продукты ядерных пр

Рядом авторов предпринимались многочисленные попытки выявить факторы, которые ответственны за образование многотяжевых а-суперспиралей (Cohen & Parry, 1990; DeGrado, et al., 1989; Lovejoy, et al., 1993; Alber, 1992; Harbury, et al., 1993; Monera, et al., 1996a, 1996b, Lupas, 1996, Hodges, 1996). Однако, пока все еще остается неизвестным, каким образом комбинавд1я эффектов упаковки гидрофобных аминокислотных остатков в межспиральной зоне и электростатических взаимодействий контролируют про

Левозаходные а-суперспирали исследуются с 1953 года, когда Криком был предсказан этот мотив, а позднее получены и расшифрованы рентгенограммы а-кератина. Возможность существования правозаходной а-суперспирали также обсуждалась рядом авторов (Lupas, 1996; Peters, et al., 1996), но только в 2000 году были получены данные рентгена с разрешением

1.8 А фрагмента правозаходной а-суперспирали. Полипептидная цепь фрагмента тетрабрахиального гликопротеина из гипертермофильной архебактерии Staphy

2.6. Структурная организация олигомерного матриксного белка сухожилий крысы (СОМР). Олигомерный матриксный белок из сзосожилий крысы (cartilage oligomeric matrix protein - СОМР) - не коллагеновый внеклеточный гликопротеин, который экспрессируется преимущественно в суставах, сухожилиях и связках (Oldberg, et al., 1992, Hedbom, et al., 1992; DiCesare, et al., 1994; Smith, et al., 1997; MuUer, et al., 1998, Guo, et al, 1998). COMP входит в семейство тромбоспондиновых генов (TSP) и является анало

На сегодняшний день наиболее хорошо изученными являются короткие а-суперспиральные комплексы (от 20 до 50 остатков). И несмотря на определенные трудности, описанные выше, рядом авторов все же бьши предприняты успешные попытки сконструировать короткие а-суперспирали с заданными свойствами. Все синтетические пептиды конструировались как димеры, тримеры и тетрамеры, ориентированные параллельно или антипараллельно, которые образовывали гомоили гетероолигомеры и являлись левоили правозаходными а-с

Синтетические пептиды были получены методом твердофазною химического синтеза с использованием автоматического пептидного синтезатора Applied Biosystems 431 А. Первичная очистка пептидов проводилась с использованием метода гель-фильтрации на колонке Sephadex G25 50x2 см в 50 % растворе уксусной кислоты. Доочистка пептидов проводилась с использованием обратнофазной хроматографии (RP-HPLC) на препаративной колонке Nucleosil 300-7 С18 с использованием градиента ацетонитрила (CH3CN) 0 - 4 5 % в

3.3.1. Измерение коэффициэнтов седиментации. Седиментационные эксперименты проводились при 20°С в буфере, содержащим

0.1 М NaCl, 10 мМ фосфата натрия, рН

2.8 с использованием аналитических ультрацентрифуг - Beckman Model Е с оптической шлирен системой и Beckman XL - А Optima с абсорбционной оптической системой. При определении констант седиментации скорость вращения ротора составляла 42040 оборотов в минуту. Константы седиментации определялись из наклона зависимости логарифма расс

3.3.2. Измерение коэффициентов диффузии Эксперименты по измерению коэффициентов диффузии проводились в аналогичных условиях, в которых проводились измерения коэффициента седиментации, при скорости вращения ротора центрифуги 12590 оборотов в минзпу. Мы использовали метод определения коэффициента диффузии D по максимальной высоте и площади пика шлирен - диаграммы (Боуэн, 1973). Известно, что Н'шах = AV(47lDt), где А - площадь пика, а Нпшх - максимальная высота пика. Из этого уравнения следует,

Молекулярная масса образцов пептидов oFFP-rgd, oFFP-lrgd, aFFP-2rgd и oFFP-Srgd определялась с использованием высокоскоростного метода седимеш-ационного равновесия на ультрацентрифуге MOM 3170 (Венгрия), оснащенной интерференционной системой оптического контроля. Исследования проводились при 20°С и скорости вращения 30 тыс. об/мин. Концентрация пептидов составляла

0.25 мг/мл в буфере, содержащим 10 мМ фосфата натрия, рН 2,8. Расчеты молекулярной массы проводились по методу Ифантиса для

Моделью для описания формы макромолекул в растворе является эллипсоид вращения, сплющенный или вытянутый. Перрен вывел уравнения, связывающие аксиальные отношения вытянутых и сплющенных эллипсоидов с величиной фрикционного отношения £'£сф (f-коэффициент трения элл1шсоида, а ]^ф - коэффициент трения сферы того же объема, что и эллипсоид) или фактора формы Перрена (F) (Кантор Ч. и Шиммел П., 1984). Так для вытянутого эллипсоида где р = Ь/а. а - большая и b - малая полуоси, соответственно. Для

Коэффициенты диффузии пептидов, исследовавшихся в главе IV настоящей диссертации, определялись из экспериментов по динамическому светорассеянию на спектрометре, описание которого приведено в статье Timchenko et al., (1990). Мощность лазера составляла 100 - 200 мкВт. Рассеяние света измерялось под углом 90°. Эксперименты проводились при 20° С. Для расширения диапазона времен корреляции использовался коррелятор времен прибытия. Обработку данных производили с помощью программы "Некорректнос

Образцы синтетических пептидов негативно окрашивались 1% раствором уранилацетата на углеродной подложке по методике, описанной в огатье Valentine et al., (1968). Углеродные пленки приготавливались с использованием электронно-лучевого испарителя, как описано Васильевым В.Д. (Vasiliev & Kotelansky, 1979). Образцы исследовали в электронном микроскопе JEM - lOOC (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 80000. Образцы синтетических пептидов, полученных напылением по кругу п

Микрокалориметрические эксперименты проводились на дифференциальном сканирующем микрокалориметре SCAL - 1 ("Скал", Россия; Senin, et al., 2000) со стеклянной ячейкой объемом

0.33 мл при скорости сканирования 1 К/мин и под давлением

2.5 атмосфер. Сбор данных осуществлялся автоматически, с шагом температзфы

0.1 К. Концентрация пептидов в микрокалориметрических экспериментах составляла 1 мг/мл в буфере, содержащем нужного состава. Для получения и значений парциальн

Мы предположили, что важным фактором в фибриллогенезе наряду с повтором длина идентичш>1х семичленников является л л Л Л Л пептида (L). Также в фибрилле отдельные а-спирали должны находится в параллельной ориентации (в терминах N-C концов) и сдвинуты относительно друг друга (рис. 15). Сдвиг одной а-спирали относительно другой (А1) должен быть кратен длине семичленника. К тому же, для Зшаковки предыдзоцей и последующей а-спирали в фибрилле по принципу "голова к хвосту" необходи

При конструировании аминокислотной последовательности семичленного повтора полипептида, способного образовывать пятитяжевую а-суперспираль, мы руководствовались следующими соображениями:

1) Хорошо известно, что во внутренних положениях а-суперспиралей (а) и (d) должны быть расположены достаточно большие гидрофобные аминокислотные остатки (лейщш (L), изолейцин (I), валин (V)), позволяющие добиться максимальной стабиханости а-суперспиралей. К тому же в ряде работ были выявлены некоторые

2.5 на поверхности исходной фибриллы полипептида oFFP имеется протяженная сеть положительных зарядов, образованная остатками аргининов (R), находящихся в положениях (f) а-суперспирали. Однако электростатические отталкивания одноименно заряженных остатков аргинина, по-видимому, частично скомпенсированы близким окружением больших остатков глутаминовой кислоты (Е), которые хоть и незаряжены в этих условиях, но способны образовывать водородные связи. Замена остатков глутаминовой кислоты (Е) неско