Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Фотоиндуцированная генерация электрических потенциалов в мембранах растительной клетки : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02

Год: 2005

Номер работы: 63346

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

. Актуальность проблемы. Преобразование световой энергии в хлоропластах зеленых растений происходит в условиях непрерывно меняющейся внешней среды. Возможности адаптации растений связаны с существованием систем регуляции, действующих на разных уровнях, включая первичные процессы фотосинтеза [89; 90; 180; 181; 69; 86; 171; 178; 195; 26; 206; 127; 222; 214; 233; 238; 199; 179]. Изменения флуоресценции (Фл) хлорофилла, отражающие состояние фотосинтетического аппарата, находят широкое применение

.

. Предположение о фотогенерации разности электрических потенциалов на тилакоидных мембранах хлоропласта было впервые высказано Митчеллом [109] и стало одним из важных положений хемиосмотической гипотезы энергетического сопряжения. Предполагалось, что генерация потенциала связана с анизотропным расположением компонентов электронотранспортной цепи (ЭТЦ) и наличием участков, где электрон пересекает центральную гидрофобную область мембраны. При такой организации окислительновосстановительных реак

1.2. Индукция флуоресценции хлорофилла зеленых растений в связи с электрогенезом на мембранах хлоропластов. При комнатной температуре энергия возбуждения хлорофилла в светособирающих комплексах ФС1 и ФС2 с высокой эффективностью передается в реакционные центры фотосистем 1 и 2 и используется в реакциях первичного разделения зарядов. Поэтому выход флуоресценции хлорофилла, входящего в ФС1 и ФС2, очень мал. Однако на ярком свету происходит накопление восстановленных продуктов на участке ЭТЦ меж

.

. Объектом исследования служили хлоропласты и клетки печеночного мха Anthoceros sp. {А. punctatus и А. laevis), а также изолированные хлоропласты высшего растения Peperomia metallica (сем. перечные - Piperaceae) [221; 194]. Хлоропласты этих растений отличаются уникально крупными размерами, благодаря чему представляют удобный объект для микроэлектродных и микрофлуориметрических измерений [180; 28; 181; 29; 35; 36; 168; 183; 27; 178; 130; 34; 184; 26; 186; 32; 182; 33; 179; 30; 37; 38; 39]. Гам

. Для проведения экспериментов была собрана установка, позволяющая совместно регистрировать индукционные кривые флуоресценции и мембранного потенциала Аф, а также наблюдать электроиндуцированные изменения флуоресценции на одиночных хлоропластах (Рис.

2.3). Установка была собрана на базе люминесцентного микроскопа Люмам-ИЗ с микрофотометрической насадкой ФМЭЛ-1 и микроманипуляторов КМ-2, используемых для подведения микроэлектродов и микропипетки к хлоропласту [32; 33]. Для измерения разн

. Для регистрации изменений флуоресценции растительных клеток и одиночных хлоропластов использовали микрофлуориметр, принципиальная схема которого приведена на Рис.

2.3. Основная часть микрофлуориметра представляет собой люминесцентный микроскоп Люмам-ИЗ с интерференционной светоделительной пластинкой и микрофотометрической ФМЭЛ-1А. Работа микрофлуориметра осуществляется следующим образом. Луч возбуждающего света проходит через систему линз и диафрагм (Рис.

2.3, позиции 1-7). Необ

. Эксперимент проводили следующим образом. На слабом проходящем свету при закрытой защитной шторке фотоумножителя подводили микроэлектрод к объекту и прокалывали хлоропласт. После введения микроэлектрода в хлоропласт проходящий свет отключали. Для подтверждения того, что кончик попал во внутренний объем тилакоидной системы и для подбора необходимого уровня компенсации сигнала флуоресценции, опыт начинали с регистрации фотоиндуцированных изменений мембранного потенциала и флуоресценции (Рис.

.

.

. На Рис.

3.1 показаны фотоиндуцированные изменения электрического потенциала Аф на тилакоидных мембранах изолированного хлоропласта Рерeromia metallica и одиночного хлоропласта Anthoceros в физиологических условиях при действии света насыщающей интенсивности. Включение света сопровождается смещением мембранного потенциала хлоропласта в положительную сторону на 30-70 мВ в течение 20-200 мс. После достижения максимального уровня регистрируется относительно медленное (в течение 2-10

3.1.2. Влияние предварительного освещения на фотогенерацию А(р. На рис.

3.2 показаны типичные изменения Аф в хлоропласте Anthoceros под действием непрерывного света после различных интервалов темноты, следующих за 1-секундным освещением. При повторном освещении после длительного темнового интервала на кинетической кривой изменений мембранного потенциала выявляются два отдельных пика (рис.

3.2). Воздействие импульса света через 20-30 с после предварительного освещения индуцирует фо

. С помощью инвертированного микроспектрофлуориметра был измерен спектр флуоресценции одиночного хлоропласта Anthoceros при комнатной температуре (Рис.

3.3). Судя по соотношению спектральных полос с максимумами при 685 нм и 735 нм на долю излучения хлорофилла ФС2 в стандартных условиях опыта приходится около 85% от всей интенсивности флуоресценции. 51 i о - 0,5 0) О (D 700 KM Рис.

3.3. Спектр флуоресценции одиночного хлоропласта Anthoceros при комнатной температуре. Форма спект

3.1.4. Одновременные измерения Aq> и флуоресценции хлорофилла: влияние темновой адаптации на кинетику изменений. На Рис.

3.5 представлены типичные индукционные кривые флуоресценции и мембранного потенциала Аф, измеренные на одиночном хлоропласте. Из рисунка видно, что в интервале менее 5 с изменения претерпевают как электрический, так и оптический сигналы. В последующий период (от 5 до 10 с с момента включения света) Аф выходит на стационарный уровень, а интенсивность флуоресценции п

3.1.5. Сравнение индукционных кривых Aq> и флуоресценции при модификациях фотосинтетической мембраны. 1). Влияние замещения Н2О на D2O. Один из способов модификации фотосинтетической мембраны заключается в изменении изотопного состава воды. Изменение свойств воды как растворителя приводит к изменению свойств и функций макромолекул, клеточных и субклеточных структур [224; 198; 150]. 58 Замещение НгО на D2O приводит к снижению эффективности разделения зарядов в реакционных центрах [224; 150]

, (1) Влияние дибромтимохинона. Дибромтимохинон (2,5-дибром-З-метил-б-пропил-р-бензохинон, ДБТХ) ингибирует нециклический транспорт электронов между ФС2 и ФС1 и ферредоксин-зависимый циклический транспорт электронов [14], препятствуя окислению пластохинона [76; 18; 78]. Вероятно, ДБТХ действует на FeS-содержащий b/f цитохромный комплекс [18]. На Рис.

3.10 показаны изменения Аф и флуоресценции хлорофилла после добавления 20 мкМ ДБТХ. В присутствии ингибитора общий уровень флуоресценции

3.2. Влияние мембранного потенциала на флуоресценцию хлорофилла.

. Наиболее прямой подход к изучению влияния мембранного потенциала на электронный транспорт в области ФС2 заключается в измерении флуоресценции хлорофилла при искусственных смещениях разности электрических потенциалов на тилакоидной мембране. Опыт начинали с введения микроэлектрода в хлоропласт и регистрации фотоэлектрического ответа тилакоидных мембран. После подбора необходимого уровня компенсации сигнала флуоресценции микроэлектрод переключали в токовую цепь. Пропускание прямоугольных импу

3.2.2. Влияние сдвигов мембранного потенциала на флуоресценцию изолированного хлоропласта. Электроиндуцированные изменения флуоресценции наблюдаются и на одиночных изолированных хлоропластах. На Рис.

3.14 показаны изменения флуоресценции изолированного хлоропласта Peperomia metallica, вызванные различным напряжением. Заметные электроиндуцированные ния) были получены при напряжении порядка 250 мВ. Напряжение меняли на участке, состоящем из последовательно соединенных микропипетки и хлоро

3.2.3. Зависимость электроиндуцированных изменений флуоресценции от редокс-состояния первичного хинонного акцептора QA . Выход флуоресценции хлорофилла а существенно зависит от окислительно-восстановительного состояния первичного хинонного акцептора электронов QA [203; 204; 233]. Состоянию с окисленным акцептором QA соответствует низкий уровень 70 флуоресценции (FQ), отражающий потери энергии в светособирающей антенне при открытых реакционных центрах [233]. Восстановление акцептора QA на ярко

3.2.4. Сравнение индукционных кривых мембранного потенциала и флуоресценции хлорофилла в хлоропластах с разной электрогенной активностью. В следующей серии опытов на одиночных хлоропластах Anthoceros и на изолированных хлоропластах Peperomia metallica сравнивали индукционные кривые флуоресценции при фотогенерации мембранного потенциала различной амплитуды. Из Рис.

3.18 видно, что в изолированных хлоропластах Peperomia metal­ lica, генерирующих фотопотенциалы небольшой амплитуды (менее 3

3.2.5. Влияние фотоиндуцированного мембранного потенциала на флуоресценцию хлоропласта. Представляется вероятным, что фотоиндуцированные изменения мембранного потенциала (Аф) оказывают влияние на ход индукционной кривой флуоресценции в первые минуты освещения. Для проверки этого предположения важно сравнить индукционные изменения флуоресценции хлоропластов в условиях с низким и высоким фотоиндуцированным Аф. При этом же78 лательно обеспечить генерацию Аф за счет активности ФС1. На Рис.

3.3. Запускаемые светом изменения мембранного потенциала клеток и их связь с энергозависимым тушением флуоресценции.

. (а) Зависимость от локализации кончика измерительного микроэлектрода и участка фотостимуляции. Величина потенциала покоя клеток мха Anthoceros, омываемых средой, содержащей КС1, NaCl и СаСЬ, в концентрациях 0,1; 1,0 и 0,5 мМ соответственно, составляет 120-130 мВ (внутриклеточное содержимое отрицательно). На Рис.

3.24 показаны изменения разности электрических потенциалов (РЭП) между микроэлектродом, введенным в хлоропласт, и внеклеточным электродом сравнения, вызываемые трехсекундным и

,

а) Снижение уровня флуоресценции и триггерный электрический ответ. Для выяснения причин, приводящих к формированию в клетках ТЭО, представляло интерес проследить связь фотоиндуцированных изменений 86 т мембранного потенциала с трансмембранным градиентом рН (АрН) в тилакоидах хлоропластов. Одним из показателей АрН в хлоропластах может служить энергозависимое тушение флуоресценции хлорофилла [23; 79; 96]. На Рис.

3.27 представлены одновременные изменения мембранного потенциала кле

.

а) Измерения мембранного потенциала и параметров флуоресценции после вспышек секундной длительности. На Рис.

3.31 представлены результаты измерений МП и параметров флуоресценции хлорофилла клеток Anthoceros до и после 3-секундного освещения синим светом. В состоянии покоя МП составлял около -120 мВ (цитоплазма отрицательна). Квантовый выход фотохимической активности ФСП • (AF/Fm) составлял

0.7-

0.82 на разных препаратах. Действующий свет вызывал быструю деполяризацию

.

4.1. Изменение мембранного потенциала н флуоресценции хлорофилла, опосредованные активацией транспорта электронов в области ФС1. При сравнении индукционных кривых флуоресценции и мембранного потенциала в интактном хлоропласте Anthoceros в идентичных условиях установлено наличие определенных связей между отдельными фазами электрического и оптического сигналов. Фотоиндуцированные изменения мембранного потенциала Аф на интактных хлоропластах антоцеротового мха Anthoceros включают два максимума (

2. Полученные результаты показывают, что мембранный потенциал (Аф) оказывает прямое влияние на выход флуоресценции хлорофилла в связи с изменением скорости отдельных стадий переноса электронов в реакционном центре ФС2. Такой механизм реализуется при наложении на фотосинтетическую мембрану разности электрических потенциалов от внешнего источника. Из представленных нами результатов видно, что усиление и уменьшение выхода флуоресценции обусловлены сдвигами Аф разной полярности, а не одной и той

. Предполагаемая схема процессов переноса электронов и дезактивации энергии возбужденных состояний в ФС2 приведена в обзоре литературы. Влияние мембранного потенциала на флуоресценцию можно объяснить изменением соотношения констант скоростей прямого и обратного переноса электронов между возбужденным пигментом Р680 и феофитином, а также изменением вероятности безызлучательной рекомбинации восстановленного феофитина с окисленным пигментом Р680. Можно предполагать, что мембранный потенциал не ок

. Для получения полной картины электрических процессов, протекающих на фотосинтетических и клеточных мембранах при освещении, нами изучены # изменения мембранного потенциала хлоропласта и запускаемые светом триггерные электрические ответы (ТЭО) в идентичных экспериментальных условиях на одних и тех же препаратах (рис. 3,24,

3.25). Дифференцированную регистрацию изменений электрического потенциала на мембранах хлоропласта и на клеточных мембранах можно достигнуть, вводя один микроэлектр