Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Генетическое действие ускоренных тяжелых ионов : диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.01

Год: 2005

Номер работы: 73567

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Актуальность проблемы. Более полувека тяжелые заряженные частицы привлекают внимание специалистов-радиобиологов как эффективный инструмент при решении фундаментальных вопросов, связанных с выяснением механизмов, лежащих в основе индуцированного мутационного процесса. На необходимость и плодотворность применения ионизирующих излучений с разными физическими характеристиками в изучении механизмов генетического действия радиации указывали Н.В. Тимофеев-Ресовский, Д.Е. Ли, Л.Г. Циммер. Результаты

ГЛАВА I ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ С РАЗНЫМИ ФИЗИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ Пристальное внимание снециалистов-радиобиологов к корпускулярным излучениям, обладающим более высокими но сравнению с рентгеновскими лучами и гамма-квантами величинами ЛПЭ, было обусловлено многими причинами. В ходе исследований, связанных с расшифровкой «радиобиологического парадокса» и формулировкой «принципа попадания» уже на ранних этапах развития радиобиологии стало очевидно, что ионизирующ

и дозиметрия При проведении объектами экспериментальных и лимфоцитами исследований с бактериальными периферической крови человека использовали ускорители многозарядных ионов Лаборатории ядерных реакций им. академика Г.Н.Флёрова У-200, У-400М и пучки высокоэнергетичных ионов, генерируемые ускорителем релятивистских тяжелых ядер «нуклотрон» Лаборатории высоких энергий им. академиков В.И.Векслера и Л.М.Балдина Объединенного института ядерных исследований. Ускоритель У-200 позволяет пол

В экспериментах были использованы разные виды и штаммы бактериальных клеток. Спорообразующие виды бактерий были представлены клетками Bacillus subtilis. В работе использованы различные штаммы клеток Bacillus subtilis дикого типа и репарационно - дефицитные мутанты: BS 168, гее Н, gsy 908, любезно предоставленные А.А.Прозоровым (Институт общей генетики РАН, Москва), и НА 101, НА 101F, полученные от Г. Хорнек (Институт космической биологии и медицины, Кёльн, ФРГ). Основной объём эксперимента

В экспериментах с бактериями Bacillus subtilis приготавливали ночные культуры, выращивая их при 37° С в NB-среде (питательный бульон "Difco" 8 г, NaCl 4 г на 1 л дистиллированной воды) до стационарной фазы (10 клеток /мл). Суспензию клеток отмывали и ресуспендировали в буферном растворе следующего состава: 0,01 М NaHP04, 0,01 М Na2HPO4, 0,2 М NaCI. После облучения клеточные суспензии десятикратно концентрировали путем центрифугирования и рассевали на чашки Петри с минимальной тверд

2.2.3. Методы облучения клеток В экспериментах с у-облучением буктериальных клеток использовали источник '^^Cs с мощностью дозы ~ 24 Гр/мин. Облучение клеточных суспензий проводили в стеклянных пробирках, при температуре 4° С. После облучения клеточные суспензии рассевали на твердую питательную среду LB для определения выживаемости и либо сразу рассевали на минимальную агаризованную среду для выявления мутантных клонов и определения частоты индукции мутаций, либо через несколько часов, посл

2.3.1. Выделение лимфоцитов из цельной крови человека Лимфоциты выделяли из свежей цельной гепаринизированной (15 ед/мл) донорской крови. Кровь (7-10

мл) смешивали с равным объемом питательной среды RPMI 1640 или фосфатного буфера (PBS) и осторожно, не нарушая границы раздела, наносили смесь на поверхность изотонического раствора фиколла (фиколл + вирографин, р = 1,077 г/мл) /В.А. Тронов, И.И. Пелевина, 1996/. После центрифугирования при 800 g в течение 20 мин, отбирали интерфазу, соде

Облучение уквантами на установке «Рокус» и на нуклотроне проводили в пластиковых пробирках объёмом 1,5 мл. При облучении у-квантами пробирки помещали в ледяную баню (0°

С) для ингибирования процессов репарации. Объем облучаемой суспензии на каждую дозу составлял 200 мкл. Клетки лимфоцитов ресуспендировали в питательной среде RPMI 1640. При облучении на нуклотроне ингибирование репарации осуществляли за счет добавления к ресуспендированным в PBS клеткам ЭДТА Na2 (рН 7,4) до концентрации

Из облученной и контрольной клеточной суспензии отбирали необходимые объемы для приготовления слайдов, а оставшуюся суспензию помещали в СОг - термостат на 37° С, предварительно добавив в RPMI 1640 эмбриональную телячью сыворотку (10%). Если облучение проводили в PBS, то его также заменяли на смесь эмбриональной телячьей сывороткой, дважды RPMI 1640 с отмыв клетки центрифугированием. Для изучения кинетики репарации из пробирок, выдерживаемых в термостате через определенные промежутки времен

Для получения тонких гель-слайдов использовали предметные стекла, на поверхность которых была нанесена «подложка» (200 мкл нормальной 1% агарозы в НгО), способствующая прилипанию слайда к стеклу /В.А. Тронов, И.И. Пелевина, 1996/. На подложке не ранее, чем за 1 ч готовили «подушку». Для этого на предметное стекло наносили 150 мкл нормальной 1% агарозы в PBS и накрывали покровным стеклом размером 24 х 24 мм, которое удаляли через 1-2 мин и слайд убирали в холодильник до момента использовани

Электрофорез нейтрально лизированных клеток проводили в низкосолевом ТАЕ - буфере (рН 8,3): 10 мМ Трис-НС1 , 25 мМ ЕДТА Na2. Для выравнивания солевой среды в геле слайд 2-3 раза ополаскивали в НгО и помещали в камеру для электрофореза, заполненную ТАЕ-буфером, и установленную в холодильнике. В таких условиях слайды выдерживали 40 мин для денатурации ДНК. Важно отметить, что воспроизводимость результатов в большой мере зависела от однородности электрического поля и качества электрофоретическо

Полученные слайды прокрашивали йодистым пропидием (PI). Для этого готовили смесь антифейда с 20 мМ Tris НС1 (рН 7-8), в которой разводили PI до концентрации 6 мкг/мл. На слайд осторожно наносили 5060 мкл краски и накрывали покровным стеклом (24 х 24 мм). Через 5-10 мин проводили измерения. Для регистрации изображений комет использовали флуоресцентный микроскоп "Axiolab" фирмы Carl Zeiss с цифровой Color chilled CCD камерой фирмы Haniamatsu. С каждого слайда регистрировали 100-200 к

Сканирование каждой кометы давало профиль интенсивности ее флуоресценции, на котором легко идентифицируются голова и хвост кометы. Обработку изображения (рис.

8) кометы проводили с помощью программы CASP /Копса et al., 2003/. В левом окне видно изображение кометы с измерительной рамкой, в которой помечены голова и хвост кометы. Измерительная рамка разбита на две рамки: фон и рамка кометы. В правом окне - видны профили интенсивности флуоресценции. Внизу отображаются результаты измерений

ГЛАВА III МУТАГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЙ С РАЗНОЙ ЛНЭ НА КЛЕТКИ BACILLUS SUBTILIS Мутагенное действие ионизирующих излучений на бактериальные клетки, также как и мутагенное влияние ультрафиолетового света, изучены, главным образом, на клетках Escherichia соИ и в меньшей степени на бактериях Salmonella typhimurium. Вместе с тем хорошо известно, что многие роды бактерий, такие как Haemophilus /Kimbal et al., 1971/, Streptococcus /Drake, Baltz, 1976/, Methylococcus /Walker et al., 1982 a,b/, D

3.1. Мутагенная SOS-снстема ренарацнн у бактерий Bacillus subtilis Прежде чем перейти к рассмотрению особенностей организации системы SOS-репарации у Bacillus subtilis, заметим, что репарационная система этих клеток имеет много общих черт с бактериями E.coli. Например, у Bacillus subtilis эффективно функционирует репарационный механизм, связанный с участием урацил N-гликозилазы /Lindahl, 1982; Alonso et al, 1988; Такао et al., 1996; Cleaver and Christopher, 1997; Krokan et al., 1997/. Эксциз

3.2. Летальное действие у-излучения на бактерии Bacillus subtilis Нри облучении клеток Е.соИ у-квантами, как известно, выявляются два типа зависимостей выживаемости (S) клеток от дозы (D) излучения: экспоненциальные зависимости, когда в полулогарифмическом масштабе выживаемость линейно уменьшается с ростом дозы излучения и зависимости сигмоидного типа, имеющие плечо на начальном участке кривых выживания. Экспоненциальные зависимости формально могут интерпретироваться как отражение особеннос

3.3. Летальное действие ускоренных тяжелых нонов на бактерни Bacillus subtilis Как уже указывалось нами ранее, зависимость ОБЭ тяжелых заряженных частиц в широком диапазоне ЛПЭ впервые удалось исследовать в 60-х годах прошлого века после постройки ускорителей тяжелых ионов в США (Калифорнийский университет) и в СССР (ОИЯИ, Дубна). В экспериментах на бактериальных клетках было выявлено, что для разных штаммов бактерий выявляются два типа зависимостей радиочувствительности (Do'') от ЛПЭ (L):

Квадратичный характер кривых Nm/N(D) при достаточно высоких дозах облучения сохраняется и при действии ускоренных тяжелых ионов (рис.20). Как можно видеть из представленных материалов, облучение клеток ионами гелия с ЛПЭ, равными 22, 42 и 72 кэВ/мкм выявляет зависимости, близкие к квадратичным функциям. Это дает возможность вычислить коэффициенты относительной генетической эффективности (ОГЭ) тяжелых заряженных частиц как отношение доз у-излучения и ионов гелия при одинаковой частоте мутирова

ГЛАВА IV ИНДУКЦИЯ ГЕННЫХ И ДЕЛЕЦИОННЫХ МУТАЦИЙ В КЛЕТКАХ E.COLI ИОНИЗИРУЮЩИМИ ИЗЛУЧЕНИЯМИ С РАЗНЫМИ ФИЗИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ Как мы уже отмечали ранее, при решении ряда актуальных задач радиационной генетики весьма важно иметь информацию не только о суммарном выходе различного рода мутаций в облученных клетках, но исключительный интерес представляют сравнительные данные о частоте образования как генных, так и структурных мутаций. В значительной степени это касается исследований закономер

Следует заметить, что исследования закономерностей образования структурных мутаций у бактериальных методическими клеток также сопряжено с Существует несколько мутаций у определенными подходов трудностями. к изучению проблемы индукции структурных прокариот. Один из них основан на определении делеций непосредственно в бактериальной хромосоме, другой - на изучении формирования делеций в искусственно сконструированных, с использованием плазмид и эписом. тест-системах. В первом случае можно

Как известно, Е.соИ имеет энергозависимую систему активного транспорта через внешнюю мембрану, состоящую из ТопВ, ЕхЬВ, ExbD белков (рис. 21). ТопВ белок взаимодействует с внешними мембранными рецепторными белками, которые выполняют высоко специфическое связывание и энергозависимый перенос различных субстратов в периплазматическое пространство /Traub et al., 1993/. Эти субстраты либо не могут проникать через пориновые каналы, либо необходимость активного транспорта обусловлена их

4.3. Летальное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки Е.соИ Прежде чем рассматривать закономерности мутационного процесса у клеток Е.соИ, индуцированного излучениями в широком диапазоне ЛПЭ, коснёмся особенностей летального действия ускоренных тяжелых ионов на бактерии Е.соИ. В разделах

3.2. и

3.3. мы рассматривали закономерности летального действия у-квантов и ускоренных тяжелых ионов на бактерии BaciHus БиЬИИз. Было показано, что при у-облучении наблюдается небольшое началь

В разделе

3.4. мы рассмотрели закономерности индукции his'->His"*' мутаций у вегетативных клеток Bacillus subtilis с различным излучений репарационным генотипом при действии ионизирующих широкого диапазона ЛПЭ. Было показано, что дозовая зависимость Nm/N(D) для клеток дикого типа при у-облучении имеет линейноквадратичный характер и этот тин зависимости сохраняется нри возрастании ЛПЭ излучений. Ранее в экспериментах на бактериях E.coli /К.Г.Амиртаев и др., 1989; Е.А.Краса

4.4.1. Закономерности нндукцни генных мутацнй у бактерий E.coli нзлученнямн с разной ЛПЭ В настоящем разделе мы рассмотрим закономерности и механизмы образования генных мутаций у клеток E.coli, подвергаемых воздействию излучений широкого диапазона ЛПЭ и сравним наши данные с более ранними результатами, полученными при использовании других генетических тест-систем. В последнее время получены крайне важные результаты, касающиеся молекулярных механизмов формирования генных мутаций у бактерий

4.4.2. Организация SOS-системы у клеток Е. соИ и индуцибельный мутагенез Исследования последних лет позволили существенно продвинуться в понимании механизмов образования генных мутаций у клеток прокариот и, главным образом, у бактерий Е.соИ. Ранее мы указывали, что индуцированный мутационный процесс у Е.соИ определяется комплексом генных продуктов, синтезируемых в ходе SOS ответа. Как показали исследования последних лет, важнейшими из них являются белки, осуществляющие umuDC-зависимый синт

4.4.3. Молекулярная модель формирования генных мутаций у бактерий E.coli нрн действии ионизирующих излучений Нри действии ионизирующего излучения в ДНК клеток, как известно, с некоторой частотой образуются прямые двунитевые разрывы (ПДР) ДНК /Е.А.Красавин, 1989/, приводящие к летальному для клетки событию, и широкий спектр первичных повреждений ДЬЖ (у-сайты). Нервичные у-сайты включают в себя разрывы фосфодиэфирных связей с разными концевыми группами, модификации азотистых оснований, АНсайты

4.4.4. Закономерности нндукцин делецнонных мутацнй у клеток Е.соИ излученнямн с разной ЛПЭ Ранее мы указывали, что изучение закономерностей образования структурных мутаций у бактерий сопряжено с определенными методическими трудностями и имеется весьма ограниченное число работ, касающихся изучения вопросов формирования делеционных мутаций у прокариотических клеток. Данные по индукции структурных мутаций у бактерий излучениями с высокой ЛПЭ в литературе отсутствуют. Среди подходов к изучению

ГЛАВАV ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСЦИЗИИ ТРАНСПОЗОНОВ В КЛЕТКАХ E.COLI НРИ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЙ С РАЗНОЙ ЛИЭ Среди широкого спектра повреждений генетических структур, вызываемых ионизирующей радиацией, особое место, как мы указывали выше, занимают структурные мутации, затрагивающих обширные области генома. Они включают такие нарушения структуры хромосомы как делеции, инсерции и транслокации последовательностей ДНК. В клетках Е.соИ структурные мутации с высокой частотой возникают при индуцируется тр

Мобильные элементы, как известно, произошли от более сложных генетических систем, которые называются регуляторными. систем генной регуляции тесно связано с изучением Открытие феномена генетической нестабильности - способности генов изменяться спонтанно, или под воздействием внешних факторов. Фенотипически нестабильность может проявляться по-разному. Например, в растениях кукурузы Zea mays это явление вызывает изменение характера пигментации зерен. Среди нормальных, равномерно окрашенных появ

5.4. Закономерности и механизмы элиминации траисиозоиов ири действии излучений с разиыми физическими характеристиками На рис.34 представлены дозовые кривые выживаемости клеток дикого типа и репарационных мутантов: recQ, recN, recO, и recA при уоблучении. Как можно видеть, все зависимости имеют экспоненциальный характер. Значения радиочувствительности клеток представлены в таблице 11. Величина чувствительности клеток дикого типа составляет 0,014 +0,02 Гр'^ и является наименьшей. Мутации в ге