Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Пространственная структура медных полиядерных оксидаз - лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima : диссертация ... кандидата химических наук : 01.04.18

Год: 2006

Номер работы: 43395

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

1.3. Медьсвязыеающие сайты ПМГБ Исторически атомы меди, координированные в белках, исходя из их спектроскопических свойств [26], подразделяются на три типа (1, 2 и 3 типы). В диапазоне спектра от ультрафиолетового до видимого медь 1 типа ("синяя" медь) дает максимум поглощения при длине волны около 610 нм, а медь 2 типа определяется методом ЭПР, в то время как двухядерный центр 3 типа не определяется методом ЭПР, Согласно данным рентгеноструктурного анализа металлоферментов, медьсвя

Среди прочих полимедных голубых белков трехдоменные составляют группу ферментов, разнообразную по составу аминокислотных последовательностей, функциям и распределению в организмах. Они найдены в грибах, в растениях, в насекомых [31, 32], а также распространены среди бактерий [33-35]. Филогенетическое древо трехдоменных полимедных голубых белков можно условно разделить на три области согласно типу 14 организма, содержащего данный белок: бактерии, растения и грибы (в последний включены и на

Лакказы являются трехдоменными ПМГБ, обнаруженными в (например, Polyporus) и деревьях грибах (Rhus). Они принадлежат к группе "голубых" оксидаз, которые могут осуществлять полное восстановление молекулярного кислорода до двух молекул воды. Предполагается, что одна из функций фермента заключается в полимеризации лигандов (фенол) и построении лигнина (полифенола), который образует клеточную стенку растений, и разложение лигнина в процессе гниения древесины, осуществляемого грибами.

Организм часто содержит несколько изоферментов, которые могут играть различные биологические роли или иметь различные оптимальные для работы условия. Папример, Coprinopsis cinerea содержит девять форм лакказы [42]. Одна из лакказ, выделенная из клеточной культуры грибов белой гнили, Pleurotus ostreatus, не имеет характерного для ПМГБ голубого цвета и атома меди 1 типа ("голубой" меди) [43]. Интересно то, что вместо обычных четырех атомов меди по ходу цепи эта белая лакказа содержит

Интересно, что лакказоподобные трехдоменные ПМГБ также имеются у насекомых. В филогенетическом древе трехдоменных ПМГБ лакказы насекомых составляют независимую группу в середине сектора грибных лакказ (рис. 3). Две лакказы табачного бражника {Manduca sexta) и одна малярийного комара {Anopheles gambiae) были клонированы и охарактеризованы [31]. Значительные различия между этими лакказами насекомых и грибными и растительными состоят в том, что у первых длиннее аминокислотная терминальная посл

Большинство данных, найденных о геномной последовательности двухдоменных полимедных голубых белков (Td ПМГБ), относится к того, что полностью решено чем геномов других бактериям. Это может быть следствием большее количество бактериальных геномов, организмов. Учитывая то, что большинство лакказ было найдено в грибах и растениях, некоторые эукариоты также могут содержать Td ПМГБ. Недавно гомодимерный белок с лакказной активностью был выделен из желтого гриба {Cantharellus cibarius) [49]. Мол

У лакказы довольно низкая специфика в отношении окисляемых субстратов. Поэтому она окисляет множество различных веществ. Хорошими субстратами являются различные фенолы: моно-, дии нолифенолы [52, 53]. Из дифенолов пара-формы окисляются наиболее быстро, орто-фенолы, например, катехол, и мета-фенолы, например, резорцинол, также окисляются со значительной скоростью. Монофенолы инактивируют лакказу, из-за чего 18 долго существовало мнение, что данный фермент не окисляет фенолы. Однако позже было

1.7. Биологическое распространение и функция лакказы Лакказоподобные ферменты были выделены из разнообразных растительных тканей, например персиков и листьев чая [54, 55]. Однако, более детальные исследования лакказы высших растений проводились на ферментах, найденных у видов китайского или японского лакового дерева (разновидности Rhus). Yoshida Н. [56] впервые обнаружил лакказу примерно в 1883 г. Он заметил, что белый сок (латекс) этих деревьев быстро затвердевает в присутствии воздуха и п

1.8, Химический состав фермеита

1.8.1. Выделение лакказы Как уже упоминалось ранее, лакказа многих видов грибов продуцируется и как внутриклеточный фермент, и как внеклеточный экзофермент [73-75]. Среди тих ферментов, внеклеточные представляют особенный интерес, так как синтез экзофермента значительно возрастает после индукции и подготовка также упрощается, поскольку образование других экзоферментов не влияет или даже уменьшается после индукции [76], Лакказа Rhus получена из лака, который выделен из множества лаковых де

1.8.2. Молекулярная масса и аминокислотная последовательность Молекулярные массы лакказ лежат в диапазоне от ~65000 до -140000 Да. Предполагается, что такой разброс существует благодаря различию в углеводной компоненте. Все лакказы, кроме Podospora I, которая является термозависимым ферментом, состоят из одной полипептидной цепи длиной приблизительно в 500 аминокислотных остатков. Хроматографические формы А и В лакказы Polyporus имеют различный аминокислотный состав, который демонстрирует, ч

Ионы металла прочно связаны в лакказе и, например, не удаляются диализом фермента против EDTA при нейтральном значении рН [94]. Ионы металла могут, однако, быть обратимо удалены нз фермента нутем диализа против цианида при рН от 7 до 8, Этот метод использовался в нескольких опытах с лакказой Rhus, из которой было удалено большинство ионов меди [79, 94], После удаления металла фермент терял активность, голубой цвет и абсорбционную полосу при 330 нм. Свойства нативных белков, восстанавливающие

Оптическая абсорбция и круговой дихроизм (CD) спектров лакказ (и церулоплазмина) во многом сходны. Пики онтического поглощения лакказ (других "голубых" белков, таких, как Az и St) преобладают в области ~ 600 нм, которой соответствует красивый синий цвет данных белков (давая в этой области сильную полосу поглощения). Молярный коэффициент поглощения, соответствующий Cu(II) в этой полосе поглощения, для различных белков находится в пределах от ~

4.000 до

6.000 М"'см'\

Даже если бы ионы металла в лакказах были хорошо изучены многими различными спектроскопическими методами, все еще не было бы известно, как металлы координируются в оксидазах. В этой связи метод рентгеновской абсорбции, использующий сильное синхротронное излучение, кажется многообещающим, так как с его помощью, в принципе, можно получить информацию о типе лигандов металлов и их расстояниях от иона металла в покоящемся ферменте или во время различных каталитических реакций. Разрешение спектра п

Ранние исследования лакказы Rhus предполагали, что все четыре иона меди вносят вклад в парамагнетизм в этом белке [89, 108]. Более поздние исследования этих ферментов, выделенных из различных лаковых деревьев, показали, что 50 - 90% общего числа ионов меди выявляется на ЭПР-спектре [109]. Исследование магнитной восприимчивости лакказы Polyporus при комнатной температуре показали, что только два из четырех ионов меди, присутствующих в этом белке, вносят вклад в парамагнетизм, а более поздние и

Первые попытки определить окислительно-восстановительный потенциал меди в лакказе были сделаны в 1958 г. Nakamura [89]. Он предположил, что все четыре иона меди в белке Rhus единообразны по своей природе и что окисленная форма, Cu(II), дает полосу поглощения при 615 нм. В снектрофотометрическом титровании с обычно используемым окислительно-восстановительным гексацианоферратным буфером Nakamura обнаружил, что этот синий хромофор восстанавливается. Он также заметил, что окисленный бело

Для отбора штаммов-продуцентов внеклеточной лакказы с высокой активностью данного фермента была иснользована коллекция культур базидиомицетов из Коллекции культур ЛЕ БИН Ботанического института им. В.Л.Комарова РАН. Объектом исследования являлись штаммы базидиальных грибов Coriolus zonatus и Cerrena maxima (Quel семейства Polyporaceae). Штамы-нродуценты внеклеточных лакказ Cerrena maxima и Coriolus zonatus были нолучены из коллекции культур базидиомицетов Ботанического института им. В.Л.Ком

В работе использовались химические реагенты: глюкоза; пептон; КН2РО4; ZnSO4*7H2O; К2НРО4; FeS04 *7Н2О; MnS04; MgS04 *7Н2О; CUSO4; СаСЬ; NaOH(yкcycнaя кислота), (NH4)2SO4, ацетат натрия, трис-малеинNaOH, цитрат натрия, глицерин, НЭГ 400, НЭГ 3000, НЭГ 4000, ПЭГ 6000, НЭГ 8000. Для первоначального скриннинга условий кристаллизации использовались набор стандартных китов, выпускаемых фирмой Hampton Research (USA): crystal screen cryo (48 различных условий), screen №1 (48 различных условий), scre

Нри выделении и очистке лакказ использовали следующие носители в хроматографических колонках: ДЕАЕ-целлюлоза ("Whatman"), сефадекс G- 33 25, волокнистая ДЕАЕ-целлюлоза (НПО-Биолар), Тоуореаг1-650М ("Тоуоsoda"), TSK 3000 ("Pharmacia").

2.2, МЕТОДЫ Основными методами при выполнении настоящего исследования являлись: кристаллизация биомакромолекул, построение стартовой модели методом молекулярного замещения и уточнение пространственной структуры. В связи с этим ниже мы приводим краткие обзоры некоторых из этих методов.

2.2.

1.1. Подбор условий кристаллизации На начальной стадии, когда необходимо найти хотя бы какие-нибудь условия кристаллизации белков метод диффузии паров в вариантах висячей или лежачей капли является наиболее оптимальным с практической точки зрения. Нриготовление кристаллизационного раствора, возможно, несколькими способами. Наиболее распространенными являются следующие два. Но первому способу кристаллизационную каплю непосредственно на поверхности, на которой будет висеть ка

Основной идеей решения проблемы фаз методом замещения является использование известной структуры молекулы начального молекулярного гомологичной (белка, РЬЖ или ДНК) в качестве модели для получения приближения набора фаз. При этом предполагается, что гомология аминокислотных последовательностей двух молекул обеспечивает схожесть их пространственных структур. Это предположение не является строго обоснованным, однако, на практике, при достаточно высокой степени 51 гомологии, данный подход част

Термин "уточнение структуры макромолекул" в широком смысле означает серию этапов исследования, включающих целый ряд различных действий: расчеты синтезов Фурье, интерактивную корректировку модели и ее автоматическую модификацию. В более узком смысле уточнением атомной модели является только автоматическая компьютерными является В корректировка, программами. стадией выполняемая специальными уточнение Кристаллографическое исследования структуры завершающей процессе макромолекул.

Исходная культура базидиомицета представляет собой пленку цвета. вегетативного, хорошо развитого воздушного мицелия белого Штаммы хранили на агаризованных косяках, которые готовили путем разбавления сусла водой в объемном соотношении 1:4 с добавлением 2% агара при температуре +4°С, реверзум не был окрашен. Культура может храниться без пересева от 6 месяцев до одного года без потери биосинтетической активности. Выращивание посевного материала проводили поверхностным способом на питатель

. Внеклеточную лакказу Coriolus zonatus выделяли из культуральной жидкости путем осаждения 90%-ным сульфатом аммония в течение 2 ч при постоянном перемешивании и рН 5,0. Осадок собирали центрифугированием при 2500 g в течение 30 мин и перерастворяли его в минимальном объеме дистиллированной воды. Препарат наносили на колонку (100x2

см) с сефадексом G-25, уравновешенную 5 мМ К-фосфатного буфера рН 6,0 (КФБ), элюцию проводили тем же буфером. Пик, содержащий ферментативную активность, нан

3.1.3. Поверхностное культивирование Сеггепа maxima. Исходная вегетативного, культура хорошо базидиомицета представляет собой пленку цвета, развитого воздушного мицелия белого реверзум не окрашен. Штаммы хранили на агаризованных косяках, которые 74 Г Т В Л путем разбавления сусла водой в объемном соотношении 1:4 с ООИИ добавлением 2% агара при температуре +4°С. Культура может храниться без пересева от 6 месяцев до одного года без потери биосинтетической активности. Выращивание посевного м

3.1.4. Глубинное культивирование Сеггепа maxima. При глубинном культивировании продуцента для индукции биосинтеза внеклеточной лакказы в питательную среду вышеуказанного состава вносили дополнительно CuS04 в количестве 0,25 г/л. Среду доводили до значения рН 6,0 и стерилизовали автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин. Дальнейший рост продуцента проводили глубинным способом в колбах. Мицелий, полученный при поверхностном выращивании культуры, размельчали керамическими бусами, находящимися

3.2.1. Кристаллизация лакказы Coriolus zonatus Поиск условий кристаллизации проводили методом диффузии паров в висящей капле с использованием набора условий для кристаллизации Crystal Screen Hampton Research. Кристаллизация фермента проведена методом диффузии паров в висячей капле. Первые кристаллы лакказы С. zonatus были получены в следующих условиях: противораствор объёмом

0.5 мл составлен из

0.2 М ацетата цинка, 25% (v/v) глицерина, 20% (w/v) ПЭГ 8000 в буфере

0.1 М какод

. Онтимизация условий нолучить кристаллы пригодные для кристаллизации нозволила анализа, рентгеноструктурного отражающие рентгеновские лучи с разрешением 2.бА. Кристаллы были выраш,ены методом диффузии наров в висячей канле. Противораствор объемом

0.5 мл содержал

0.2 М сульфата аммония,

0.1 М ацетата натрия (рН

4.6), 25 % (w/v) нолиэтиленгликоля 4000. Кристаллизационный раствор объемом 6 мкл состоял из белка с концентрацией 8 мг/мл в 50 мМ цитратном буфере (рН

3.2.2. Кристаллизация лакказы Сеггепа maxima. Кристаллы были выращены нри температуре 298°К методом диффузии паров в висячей капле. Кристаллизационный раствор объемом 6 мкл состоял из белка с концентрацией 8мг/мл в 50мМ буфере цитрата натрия, 15% (w/v) полиэтиленгликоля 6000 в буфере

0.04М трис-малеин-NaOH, рН

5.5. Противораствор осадителя содержал 30% (w/v) полиэтиленгликоля 6000 в буфере

0.04М трис-малеин-NaOn, рН

5.5. Кристаллы были выращены в течение трех недель.

3.3. Получение набороврентгенодифракционных данных

3.3.1. Набор интенсивностей дифрагироваииых кристаллом лакказы Coriolus zonatus Получение рентгенодифракционных первого экспериментального и его обработка набора проведены интенсивностей К.Ширвитц (рабочая грунпа В.С.Ламзина) в Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии (Гамбург, Германия) [211]. Набор собран с одного кристалла при температуре 100°К на рабочей станции XII, синхротронный источник DEZY (Гамбург, Германия). Кристалл отражал рентгеновские лучи с разрешением

3.2 А. Диф

3.3.2. Экспериментальный набор интенсивностей дифрагированных кристаллом лакказы Сепепа maxima. Дифракционные данные для кристаллов лакказы С. maxima был получен при температуре 100°К на белковой станции XI3 (EMBL, DESY, Гамбург, Германия) до разрешения

1.9 А при длине волны

0.8068 А. В качестве криораствора был использован противораствор, содержащий 20% (v/v) ПЭГ 400. Экспериментальный набор модулей структурных амплитуд для обоих кристаллов получен с помощью программы XDS [212].<

Для определения структуры лакказы из С. zonatus с разрешением

3.2 А был применен метод молекулярного замещения с использованием в качестве стартовой модели пространственной структуры молекулы лакказы Trametes versicolor при разрешении

1.9А (PDB, код 1GYC). Структура именно этого фермента была выбрана после предварительного сравнения молекулярных весов и валового состава первичных последовательностей молекул ряда лакказ из различных источников белков. Как молекулярные веса, так и в

3.4.2. Построение стартовой модели структуры лакказы Сеггепа maxima. Решение задачи было осуществлено методом молекулярного замещения по программе MolRep из программного комплекса ССР4. Стартовой моделью была выбрана пространственная структура лакказы Trametes versicolor (PDB code: IKYA). Ионы меди, молекулы углеводов и молекулы растворителя были исключены из стартовой модели. Истинное решение соответствовало максимумам функций вращения и трансляции, для которых Rfact и Rcorr имели значение

5.5. Уточнение структуры

. Уточнение пространственной структуры лакказы C.zonatus с разрешением

3.2 А проводилось с использованием опций anneal, minimize, bgroup программного комплекса CNS. В ходе решения структуры для обеспечения контроля процедуры уточнения из экспериментальных данных в самом начале работы были отобраны случайным образом 5% отражений, которые образовали контрольный набор, использовавшийся далее для расчета свободного R-фактора (Rfree). Позиции атомов модели лакказы и их температурные факторы

3.5.2. Уточнение структуры лакказы Сеггепа maxima. Структура лакказы Сеггепа maxima с разрешением

1.9А уточнена с использованием комплексов программ CNS и REFMAC. После нескольких циклов уточнения как твердое тело (rigid-body) величины Rfact и Rfree уменьшились до значений

0.368 и

0.382, соответственно. Дальнейший цикл уточнения как restrained refinement снизило величины Rfact и Rfree до

0.275 and

0.331. Для контроля процедуры уточнения был использован контрольны

При выделении лакказы была использована методика, описанная в главе «Материалы и методы». Исходная культура базидиомицета представляет собой пленку вегетативного, хорошо развитого воздушного мицелия белого цвета. Штаммы хранили на агаризованных косяках, которые готовили путем разбавления сусла водой в объемном соотношении 1:4 с добавлением 2% агара при температуре +4°С, реверзум не окрашен. Культура может храниться без пересева от 6 месяцев до одного года без потери биосинтетической активно

Внеклеточную лакказу Coriolus zonatus выделяли из культуральной жидкости путем осаждения 90%-ным сульфатом аммония в течение 2 ч при постоянном перемешивании и рН 5,0. Осадок собирали центрифугированием при 2500 g в течение 30 мин и перерастворяли его в минимальном объеме дистиллированной воды. Препарат наносили на колонку (100x2

см) с сефадексом G-25, уравновешенную 5 мМ К-фосфатного буфера рН 6,0 (КФБ), элюцию проводили тем же буфером. Пик, содержащий ферментативную активность, нанос

4.3. Получение биомассы для выделения лакказы Сеггена maxima.

. Исходная вегетативного, культура хорошо базидиомицета представляет собой пленку цвета, развитого воздушного мицелия белого реверзум не окрашен. Штаммы хранили на агаризованных косяках, которые готовили путем разбавления сусла водой в объемном соотношении 1:4 с добавлением 2% агара при температуре +4°С. Культура может храниться без пересева от 6 месяцев до одного года без потери биосинтетической активности. Выраш,ивание посевного материала проводили поверхностным способом на питательной

При глубинном культивировании продуцента для индукции биосинтеза внеклеточной лакказы в питательную среду вышеуказанного состава до вносили дополнительно CuS04 в количестве 0,25 г/л. Среду доводили 85 значения рН 6,0 и стерилизовали автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин. Дальнейший рост продуцента проводили глубинным способом в колбах. Мицелий, полученный при поверхностном выращивании культуры, размельчали керамическими бусами, находящимися в колбе, до малых размеров. Полученный таки

4.4. Очистка лакказы Сеггепа maxima Внеклеточную лакказу, синтезируемую базидиомицетом С. maxima выделяли из культуральной жидкости продуцента, выращенного в условиях глубинного культивирования, путем осаждения 90% сульфатом аммония в течение 2 часов при постоянном перемешивании и контроле рН. Осадок собирали центрифугированием при 2500 g в течение 30 мин и перерастворяли его в 200 мл дистиллированной воды. После 24-х часового диализа против 0,005 М К-фосфатного буфера рН 6,0 лакказу наносил

. Поиск условий кристаллизации проводили методом диффузии паров в висящей капле, как описано в главе «Материалы и Методы». Задача кристаллизаторов на первом этапе заключается в том, чтобы найти область многопараметрического пространства, где возможны нуклеация и рост твердой фазы в виде кристаллов. Вышеуказанную задачу решают методами скрининга, предполагающими одновременное опробирование возможности кристаллизации в серии опытов при разных условиях. Поэтому на первом этапе нами была проведен

Первые кристаллы были получены Пегасовой Т.В. и отражали рентгеновские лучи с разрешением

3.2 А. В данной работе первые кристаллы были получены в растворе, где в качестве осадителя использовался полиэтиленгликоль 8000. Кристаллизационный раствор объемом 10 мкл содержал белок с концентрацией 9мг/мл,

0.1 М ацетат цинка,

0.05 М в 50 мМ какодилат натрия, 10% (w/v) ПЭГ 8000 и

12.5% (v/v) глицерин калий-фосфатном буфере, рН

6.5(рис. 6). Рис.6. Кристаллы кристаллизац

. Первые кристаллы были получены в растворе объемом 6 мкл, состояш,ем из белка с концентрацией 8мг/мл в 50 мМ буфере цитрата натрия, 15% (w/v) полиэтиленгликоля 4000 в

0.1М буфере малоната натрия рН

5.5,

0.01М хлорида кальция (рис. 8). Рис.8. Кристаллы лакказы из Сеггепа maxima, полученные на стадии подбора условий кристаллизации Дальнейшая кристаллизация и поиск оптимальных условий кристаллизации позволили получить кристаллы, отражающие рентгеновские лучи с разреш

Процедура получения наборов дифракционных данных, и определение пространственной структуры белка описано в главе «Методы». Далее представлено более подробное описание этих экспериментов. Перед съемкой из капли выбирался наиболее крупный и ограненный кристалл, хорошо светящийся в поляризованном свете. Кристалл перекладывали на несколько секунд в соответствующий криораствор, а после этого очень быстро помещали в струю жидкого азота. С замороженных кристаллов были получены наборы дифракционных

4.6.1. Получение наборов дифракционных данных от кристаллов лакказы Coriolus zonatus. Получение рентгенодифракционных первого экспериментального и его обработка набора проведены интенсивностей К.Ширвитц (рабочая группа В.С.Ламзина) в Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии (Гамбург, Германия). Набор собран с одного кристалла при температуре 100°К на рабочей станции XII, синхротронный источник DEZY (Гамбург, Германия). Кристалл отражал рентгеновские лучи с разрешением

3.2 А. Кри

3.2 Л Для определения структуры лакказы из С. zonatus с разрешением

3.2 А был применен метод молекулярного замещения с использованием в качестве стартовой модели пространственной структуры молекулы лакказы Trametes versicolor при разрешении

1.9А (PDB, код 1GYC). Структура именно этого фермента была выбрана после предварительного сравнения молекулярных весов и валового состава первичных последовательностей молекул ряда лакказ из различных источников белков. Как молекулярные

Дифракционные данные для кристаллов лакказы С. maxima были получены при низкой температуре (PEG-400 был использован в качестве криопротектора) на станции XI3 (EMBL, DESY, Гамбург, Германия) при длине волны

0.8068 А. Перед съемкой из капли выбирался наиболее крупный и ограненный кристалл, хорошо светящийся в поляризованном свете. Кристалл перекладывали на несколько секунд в соответствующий криораствор, а после этого очень быстро помещали в струю жидкого азота. С замороженных кристаллов

. В случае лакказы С. maxima определение положения стартовой модели молекулы также было проведено методом молекулярного замещения по программе MOLREP из программного комплекса ССР4. При расчетах методом молекулярного замещения с использованием различных моделей лакказ наилучшую корреляцию с рентгеновскими данными для лакказы С. maxima дала модель лакказы Trametes versicolor (PDB-код: lKYA), Структура именно этого фермента была выбрана в качестве исходной модели для решения структуры после пре

. Уточнение пространственной структуры лакказы С. zonatus с разрешением

3.2 А проводилось с использованием опций anneal, minimize, bgroup программного комплекса CNS. В ходе решения структуры для обеспечения контроля процедуры уточнения из экспериментальных данных в самом начале работы были отобраны случайным образом 5% отражений, которые образовали контрольный набор, использовавшийся далее для расчета свободного R-фактора (Rfree)- Позиции атомов модели лакказы и их температурные фактор

Сравнение нервичных носледовательностеи исследуемой лакказы из С. zonatus с разрешением

3.2 А и лакказы из T.versicolor ноказывает, что в процессе решения и уточнения аминокислотных остатков (рис.

22) структуры было сделано 136 замен model : C.zon : 100 120 S FLYDFJWP DQ aGTFWYH S HLgfTQYCDG! SFLYDFSSPDQдетFWYHSНЬЩГQYCDG 140 model : .GPFVVYDPNDP i ; C.zon : I ! GPFVVYDPHDP iMiiLHi model : ТИП C.zon : 160 200 model : T C.zon : P 260 model : C.zon : 320 model : ЫЕУ^ЩЦУАТ/ C.zon :

Анализ пространственной структуры лакказы С. maxima показывает ее большое сходство с другими лакказами, кристаллические структуры которых были исследованы. Лакказы Coriolus zonatus и Cerrena maxima представляют собой одноцепочечную молекулу (499 аминокислотных остатков), состоящую из трех купредоксино-подобных доменов: I (остатки 1-131), II (132-309), и III (310-499) (рис. 29). II домен S1 I домен Рис. 29. Пространственная структура молекул лакказ В первом домене можно выделить 7 (З-л

В молекуле лакказ существуют два канала, обеспечивающие доступ к трехъядерному центру (рис. 35). Внутри этих каналов локализованы молекулы воды, образующие многочисленные водородные связи (в пределах

2.5

3.2

А) или между собой, или с аминокислотными остатками, формирующими стенки канала. Первый канал обеспечивает доступ молекул кислорода с поверхности белковой молекулы к ионам меди ТЗ - типа. Второй канал служит для транспорта молекул воды от Т2-центра на поверхность белка

4.16. Углеводная компонента лакказы Сеггепа maxima Как упоминалось ранее, лакказы, как и все голубые оксидазы, являются гликопротеинами. Углеводная часть большинства лакказ составляет 10 - 13% от массы молекулы белка. При анализе разностных карт электронной плотности для лакказы С. maxima обнаружены области высокой электронной плотности на периферии молекулы вблизи аминокислотных остатков Asn54, Asn217, Asn333 и Asn436, которые были интерпретированы как карбогидраты, присоединенные к соответ