Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Ингибирование теломеразы человека : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10 / Ажибек Дулат Мейирбекович; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова]

Год: 2015

Номер работы: 738107

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

. Активирование

Введение в обзор литературы препятствует укорочению хромосом в теломеразы процессе репликации и обеспечивает неограниченный потенциал деления клеток [11]. Известно, что теломераза активна в эмбриональных, стволовых, половых и опухолевых клетках [12,13]. Теломераза является перспективной мишенью для противораковой терапии. Однако, использование ингибиторов теломеразы может сопровождаться побочными эффектами, затрагивающими, в первую очередь, стволовые необходима для клетки, в которых теломер

1.2 Иммунотерапия Теломераза является РНК-белковым комплексом, состоящим в основном из hTERT и hTR. В клетке экспрессия hTERT коррелирует с активностью теломеразы, тогда как hTR присутствует, предположительно, во всех тканях [17]. В связи с этим hTERT считается наиболее селективной мишенью среди всех компонентов теломеразы. Использование hTERT как мишени предполагает на два подхода: иммунотерапию и генную терапию. Иммунотерапия — это стимуляция иммунной системы пациента для атаки опухолевых к

1.3. Генная терапия Для генной терапии предполагается использовать искусственный вирус, либо являющийся литическим вирусом, либо содержащий «суицидный» ген под промотором, который специфически активен в опухолевых клетках. Преимуществом генной терапии является быстрая гибель клеток, что было показано in vitro [29]. Кроме того, можно использовать несколько промоторов одновременно, что показано в работе [30]. Примером может служить литический вирус CG5757, который содержит промоторы hTERT и E

1.4. Ингибирование работы теломеразы Теломераза активна в половых, стволовых и опухолевых клетках. При ингибирований теломеразы опухолевые клетки продолжают делиться некоторое время до критического укорочения теломер, после которого вступают в апоптоз [33]. Период между началом ингибирования теломеразы и индуцированным укорочением теломер и апоптозом, называют лаг-временем. Этот период может составить до 100 дней в зависимости от типа клеток [34]. Однако, если длина теломер в опухолевых кле

1.4.1. Методы измерения теломеразнои активности Для исследования ингибирования теломеразы, в первую очередь, необходим надежный метод. Из-за низкой концентрации теломеразы в клетке (100 молекул на 1 клетку) [35] детекция компонентов теломеразы и ее активности становится сложным процессом. Первым для исследования теломеразы использовался прямой метод детекции теломеразнои активности [36]. Этот метод основан на удлинении праймера теломеразой в клеточном экстракте в присутствии радиоактивно ме

1.1. ТРАП анализ Исследование теломеразы начало бурно развиваться после разработки метода амплификации теломерных повторов (ТРАП) в 90-е годы прошлого столетия [38]. ТРАП состоит из 3 основных шагов: удлинение праймера теломеразой, амплификация получившегося продукта (продуктов) и детекция. На шаге удлинения теломерные повторы прибавляются теломеразой, присутствующей в клеточном экстракте, к олигонуклеотиду TS (telomerase substrate) — теломеразному субстрату. Отличительная особенность этого

1.2. Устранение ингибирования ПЦР Большинство лабораторий для устранения ингибирования ПЦР используют очистку продуктов удлинения теломеразои перед ПЦР. Есть несколько видов очистки перед ПЦР: фенольная депротеинизация с последующим осаждением (Ф/О) [49,50], очистка продуктов удлинения теломеразои на колонке [51], аффинная очистка [52]. При методе Ф/О реакционную смесь после теломеразной реакции обрабатывают насыщенным раствором фенола для депротеинизации, и осаждают теломеразный

1.3. «In vivo ТРАП» Измерение теломеразной активности прямо в клетке осуществляется в условиях in situ [53]. Под названием «in манипуляция с теломеразой в клетке с vivo ТРАП» подразумевается выделением последующим 26 теломеразного экстракта и проведением ТРАП [54]. Для этого клетку обрабатывают ингибитором теломеразы и культивируют в течение нескольких дней. Обработанные клетки лизируют и получают экстракт, содержащий теломеразу. Далее экстракт анализируют по протоколу in vitro ТРАП

1.4.2. Низкомолекулярные вещества и Иметелстат Низкомолекулярные вещества как ингибиторы теломераз обладают рядом преимуществ. Их производить и транспортировать намного легче, чем антитела, пептиды, ДНК, бактериофаги и т.д., из-за этого их стоимость намного ниже. Также есть возможность веществ, модификации чтобы химической структуры низкомолекулярных улучшить фармакокинетику, специфичность и т.д. Порядка 90% лекарственных препаратов на мировом рынке фармакологических препаратов являются

1.5. Ингибирование биогенеза теломеразы В клетках активная теломераза синтез, появляется в результате процессинг и сборку сложного процесса, объединяющего компонентов теломеразы. В связи с этим мишенями для ингибирования теломеразы могут быть не только компоненты теломеразы, но и процессы синтеза и сборки этого комплекса (рис.1). Однако необходимо учитывать, что механизмы биогенеза теломеразы не до конца изучены. На данный момент биогенез отсутствуют теломеразы, целенаправленно разработа

1.5.1. Ингибирование транскрипции hTERT Экспресссия мРНК hTERT характерна для опухолевых клеток [77], тогда как роста экспрессии hTR нет. В связи с этим считается, что экспрессия hTERT является основным механизмом регуляции теломеразы, поэтому транскрипция обратной транскриптазы теломеразы — привлекательная мишень для ингибирования теломеразы. Последовательность, необходимая для активности промотора hTERT, имеет длину порядка 200 п.о. и GC-богата (рис.14). а. w i Рис. 14. Схематическое пр

1.5.2. Ингибирование посттрансляционной модификации hTERT Известно, что теломеразная обратная транскриптаза hTERT фосфорилируется и это необходимо для активности и клеточной локализации теломеразы [86]. Следовательно, фосфатазные и киназные ингибиторы могут непосредственно влиять на теломеразу. Например, окадаевая кислота (рис.

16) является ингибитором фосфатазы 2А. Известно, что фосфатаза 2А ингибирует теломеразу. Обработка клеточной линии опухоли молочной железы окадаевой кислотой пр

1.5.3. Уменьшение доступности теломер для теломеразы Отличительная особенность ДНК теломер в том, что она G-богата и состоит из повторяющихся последовательностей, за счет чего нуклеотиды G находятся на одинаковом расстоянии друг от друга. Это позволяет одноцепочечному концу теломер образовывать G-квартеты (рис.17А) и Gквадруплексы (рис.17Б) [93]. г_~-т \т А а H-N н у-н Н о оЧОм ,н я-н «Ч . в—4 а о' \ ! о f

1.1 Рис. 17. Структура: А - G-квартета, Б — G-квадруплекса. Со

х107

0.06 >25 - концентрация вещества, при которой время удвоения клеток возрастает в 2 раза. При культивировании клеточной линии рака шейки матки (UXF1138L), которая имеет очень короткие теломеры (2,7тыс. п.о.), в присутствии BRACO19 старение клеток начиналось на 15-ый день обработки [100]. Этого времени не достаточно для прохождения числа делений, которое бы приводило к значимому укорочению теломер. Оказалось, что 04-лиганды действуют по механизму, который активирует ответ на появл

1.5.4. Олигонуклеотиды для ингибирования теломеразы Олигонуклеотиды являются эффективными инструментами в молекулярной диагностике [107] и функциональной геномике [108], а главное, рассматриваются, как перспективные терапевтические средства [109]. Технологии регулирования клеточных процессов на основе олигонуклеотидов продемонстрировали свою эффективность in vitro и in vivo [110,111]. На сегодняшний день используются различные подходы: антисмысловая технология, РНК-интерференция, аптамеры

4.1. Применение олигонуклеотидов, взаимодействующих с мРНК hTERT В большинстве случаев именно экспрессия каталитической субъединицы hTERT коррелирует с активностью теломеразы [17], а мРНК hTERT 46 используется в качестве маркера опухолевого процесса. Применение hTERT, антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных мРНК инактивирует теломеразу, что препятствует пролиферации опухолевых клеток, а при достижении критической длины теломер в них индуцируется апоптоз. Было показано, что олигон

4.2. Воздействие олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы на hTR Олигонуклеотиды, комплементарные теломеразной РНК hTR, ингибируют теломеразу несколькими способами: например, уменьшая время жизни hTR в клетке [135], блокируя сборку теломеразы [136] или ингибируя полимеразную активность теломеразы in vitro [137]. Именно к последнему типу относятся, рассмотренные выше в странице 29, антагонисты матричного участка теломеразной РНК. Уменьшение времени жизни hTR в клетке может быть достигнуто дег

4.3. Олигонуклеотидные ингибиторы, нарушающие сборку теломеразы Ингибирование взаимодействия Олигонуклеотиды, сборки теломеразы РНК и основано на блокировании субъединицы. для теломеразной каталитической комплементарные участкам hTR, необходимым взаимодействия с компонентами теломеразного комплекса, нарушают сборку теломеразы. В этом случае подавление теломеразной активности в клетках достигается за счет уменьшения количества корректно собранной активной теломеразы [136]. Нарушение сбор

2.1. Разработка метода детекции теломеразной активности В связи с этим, появилась необходимость по модификации ТРАП для исследования ингибирования теломеразы веществами различной природы, в том числе олигонуклеотидами. Существует три важных аспекта для успешной реализации ТРАП: 1 - чистота теломеразы, 2 - отсутствие ингибирования ПЦР, 3 — количественность анализа. Проблема количественности анализа была рассмотрена в литературном обзоре, она решается с помощью использования ПЦР в реальном вре

2.1.1. Очистка теломеразного экстракта Большинство исследователей в качестве источника теломеразы на первом этапе используют клеточные экстракты. Самым известным является S100 экстракт. Для его получения вначале клетки лизируют, полученный лизат центрифугируют при низких скоростях, обычно это до 16000g. Это дает возможность избавиться от клеточного дебриса. Супернатант, полученный после центрифугирования клеточного лизата, называется S16 экстрактом. Далее S16 экстракт центрифугируют при 100 0

2.1.2. Устранение ингибирования ПЦР При скринингах ингибиторов теломеразы методом ТРАП очистка теломеразного продукта перед ПЦР абсолютно необходима, т.к. ингибиторы теломеразы обычно ингибируют и ПЦР. Теломераза и ДНК-полимеразы являются полимеразами и имеют сходные структуры. Одной из целей нашей работы было исследование ингибирования теломеразы олигонуклеотидами, которые по своей природе одинаковы с продуктом теломеразы, из-за чего очистка с помощью депротеинизации/осаждения и/или выделен

2.1.3. Проверка метода на низкомолекулярных С4-квадруплекс лигандах Адекватность предложенного подхода проверили, используя соединения с известным IC50, определенным ранее другими методами. Для этого выбрали низкомолекулярное соединение BIBR1532. Его IC50 составило 0,214±

0.038мкМ, что намного лучше соответствует результатам измерения прямым теломеразным методом (1С50~0,1мкМ), чем обычным ТРАП методом (IC50 4-5мкМ) (см. литобзор стр.21). Однако известно, что BIBR1532 не ингибирует ПЦР

2.1.4. Ингибирование теломеразы новым металлорганическим соединением, содержащим медь Разработанный нами метод был дополнительно протестирован на новом металлорганическом соединений. Открытие цисплатина привело к росту исследований в области применения металло-лекарств в противоопухолевой терапии. Из не-платиновых соединений большой интерес вызывают соединения меди, т.к. ее координационные свойства хорошо изучены, а также показано, что цитотоксичность некоторых металлорганических соединении

2.1.5. Рекомбинантная экспрессия теломеразы и вальпроевая кислота Недостаток использования разбавления для исключения ингибирования шага ПЦР в методе ТРАП исследуемыми веществами заключается в том, что при сильном разведении концентрация теломеразного продукта становится меньше предела чувствительности ПЦР, в результате на шаге ПЦР не происходит амплификация теломеразного продукта. В связи с этим необходимо повышать концентрацию теломеразного продукта. Для этого необходимо повысить концентр

2.2. Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы

2.2.1. Дизайн химерных бифункциональных олигонуклеотидов Основной целью нашей работы была разработка новых подходов ингибирования теломеразы. Известно, что теломеразная РНК имеет два домена, связывающиеся с hTERT и необходимые для работа теломеразы: псевдоузел и CR4/CR5. Было показано, что теломераза не теряет свою активность при экспрессии этих доменов отдельно друг от друга [164]. Также известно, что в условиях in vitro теломераза является димером, и эта димеризация, предположительно, нео

2.2.2. Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vitro Для каждого олигонуклеотида при каждом измерении было проведено параллельное тестирование влияния на ПНР реакцию. Влияние на ПЦР проверяли добавлением ингибиторных олигонуклеотидов после проведения теломеразной реакции. При этом если олигонуклеотид ингибирует ПЦР, то сигнал по сравнению с контролем, в котором отсутствует олигонуклеотид, будет ниже. Олигонуклеотиды Ми J по отдельности достаточно хорошо ингибируют теломеразу

2.2.3. Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo Учитывая что олигонуклеотидные части химер могут мешать сборке теломераз, мы изучили их влияние на теломеразную активность в условиях in vivo на клеточной линий. Для этого клетки НЕК293 были трансфецированы этими олигонуклеотидами и культивированы в течение двух дней. Затем теломеразная активность полученных клеточных экстрактов была измерена методом RQ-ТРАП. Полученные данные приведены в табл. 6. Примеры начальных графиков

3.1. Проверка ингибирования ПЦР реакции для in vivo ТРАП метода Хорошо известно, что ингибиторы теломеразы могут также ингибировать шаг ПЦР в ТРАП in vitro [40,41]. Однако на данный момент отсутствуют работы, в которых проверялось бы ингибирование ПЦР для метода ТРАП in vivo. Существует предположение, что олигонуклеотиды могут адсорбироваться на поверхности цитоплазматической мембраны, не проникая внутрь клетки, совыделяться с теломеразой и ингибировать теломеразу при дальнейшей постан

3.2. Стабильность химерных олигонуклеотидов в клеточных линиях и защита 5'-конца На данный момент не существует корректных универсальных методов определения стабильности олигонуклеотидов в клетке. В основном о стабильности олигонуклеотидов судят по функциональному анализу. Известно, что олигонуклеотиды могут деградировать как внутри, так и с 3'- и 5'-конца. С З'-конца мы защитили олигонуклеотиды аминолинкером и исследовали стабильность, связанную с 5'-концом. Олигонуклеотиды Mc3N* и M*c3N

3.3. Длина и расположение линкера Для исследования влияния длины линкера на ингибирующую способность кроме химеры Mc3N, были синтезированы олигонуклеотиды, соединенные через триэтилен и гексаэтилен гликоль. MNc3 был использован как контроль с нулевой длиной линкера. Во всех олигонуклеотидах 5'-конец не защищен. Результаты представлены на рис. 36. Полученные данные показывают, что длина линкера между олигонуклеотидами не влияет на их ингибирующую способность. 85 Присутствие линкера с 5'-ко

3.4. Специфичность химерных олигонуклеотидов Химерные олигонуклеотиды ингибируют теломеразу в условиях in vivo намного эффективнее, чем в in vitro (табл. 6). Известно, что 2'-алкил модификация олигонуклеотидов увеличивает их специфичность [168]. Однако наше подозрение в специфичности вызвали химерные олигонуклеотиды состоящие из N и J частей. Так как в условиях in vitro эти олигонуклеотиды не ингибируют теломеразу, тогда как в системе in vivo сравнимы с остальными химерными олигонуклеотидами

3.5. Токсичность химерных олигонуклеотидов Для подтверждения специфичности действия химерных олигонуклеотидов только на теломеразу также была проверена токсичность наиболее активных химерных олигонуклеотидов на клетки НЕК293Е методом МТТ (рис. 38), так как ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo может быть обусловлено их цитотоксическим действием. В случае M*c3N и N*c3J (рис. 38 Д и

Е) виден незначительный спад выживаемости. Он начинается с концентрации 10 нМ и не д

3.6. Уровень теломеразной РНК в системе in vivo в присутствии химерных олигонуклеотидов Известно, что 2'-алкильные олигонуклеотиды не являются субстратом для РНКзы-Н и не вызывают деградацию РНК мишени. Однако выше мы показали, что из-за недостаточной специфичности, возможно, химерные олигонуклеотиды имеют другие пути ингибирования теломеразы. Один из возможных путей - деградация hTR. В связи с этим мы решили проверить стабильность hTR в клетках в присутствии химерных олигонуклеотидов. z

3.7. Сборка теломеразного комплекса в присутствии химерных олигонуклеотидов в условиях in vivo Из предыдущих данных видно, что химерные олигонуклеотида не ингибируют теломеразу за счет деградации hTR и не имеют цитотоксического воздействия на клетки. Если эти олигонуклеотды запускают какие-то сигнальные пути, то могут ингибировать теломеразу за счет подавления экспрессии или пост-трансляционной модификации hTERT. Однако наиболее вероятный и простой механизм ингибирования теломеразы в клетке

.

Заключение Ингибирование активности является ПЦР в ТРАП методе определения теломеразной одной из серьезных проблем при скринировании потенциальных ингибиторов теломеразы. На данный момент отсутствует универсальный метод устранения ингибирования ПЦР квадруплекс 94 стабилизирующими препаратами, а для олигонуклеотидных ингибиторов таких методов вовсе нет. В данной работе был разработан универсальный метод устранения ингибирования ПЦР, основанный на разбавлении теломеразного пр

3.1. Реактивы и биопрепараты В работе были использованы следующие реактивы и препараты: NaCl, NaOAc, KCl, MgCl2, NaOH, КОН, H3BO3, CuCl2, персульфат аммония, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, глицерин, Taqполимераза фирм Merk, Германия и Helicon, Россия; Tween (DTT), 20, акриламид, Кумасси R-250, ^№-метиленбисакриамид, Д-глюкоза, 1,4-дитиотреитол N,N,N',N'- 2-меркаптоэтанол, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), Helicon, Россия фенол, уксусная кислота, соляная кислота, хлорофо

3.2. Получение S100 экстракта НЕК293Т клетки, вырашенные в 10 см чашке Петри промывали lx PBS буфером, ресуспендировали в 2мл CHAPs буфере и инкубировали 30 мин во льду. Затем лизат центрифугировали при lOOOOOg, бОмин, 4°С. Полученный S100 экстракт разаликвотили по 5-40 мкл и быстро заморозили в жидком азоте. Хранили при температуре -80°С.

3.3. Проверка деградации олигонуклеотидов в S100 экстракте При проверке деградации олигонуклеотида, 20мкл смеси, содержащей 2мкл аликвоты S100 экстракта, 4мкл 5х ТРАП буфера и 1мкМ олигонуклеотида N, инкубировали разное время при 37С. После окончания инкубации смесь инактивировали добавлением 20 мкл фенола и перемешиванием с помощью вортекса. Центрифугировали 16000 g, 2мин. Отбирали водную фазу. К водной фазе добавили 4мкл 6х LD буфера. Электрофорез проводили в 20% денатурирующем полиакрилам

3.4. ТРАП с визуализацией в полиакриламидном геле («Классический» ТРАП) Готовили смеси из 10 мкл 5хТРАП буфера, 1мкл TS-праймера 20мкМ, 2мкл dNTP (по

2.5 мМ dATP, dGTP, dTTP, dCTP), добавляли соответствующий олигонуклеотид для ингибирования и доводили до 49,5мкл деионизованной 101 водой. Приливали по 0,5мкл клеточного S100 экстракта, перемешивали, и инкубировали при 25°С на 30 мин. После шага удлинения праймера к смеси приливали 1мкл АСХ-праймера 20мкМ, 0,4мкл Taq-полимеразы (5и/мкл). П

3.5. Клонирование

3.5.1. Получение конструкции для рекомбинантной экспресии теломеразы Для экспрессии теломеразы человека были получены плазмиды для экспрессии основных компонентов теломеразы: для hTERT p-DS-SFFV-hTERT и для hTR pBSK-DS-Ul-hTR. pBSK-DS-Ul-hTR получали вставкой DS элемента в плазмиду pBSK-Ul-hTR-U2/U5 (подарок от Shang Li [170], содержащая hTR ген под U1 промотор в pBluescript векторе), которую предварительно обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Kpnl и Sail. DS элемент является частью ориджи

3.5.2. ПЦР В пробирке 0,2 мл составляли следующую ПЦР смесь: 1 Ох буферный раствор для Taq-полимеразы матричная ДНК (плазмидная или геномная) праймер 1 праймер 2 смесь dNTP MgCl2 Полимераза Taq или Taq:Pfu (10:1) (5 ед/мкл) 5 мкл 1 мкг 20 пмоль 20 пмоль по 0,1 мМ каждого 1 мМ

0.5 мкл до 50 мкл н2о Тщательно перемешивали и помещали в прибор для проведения ПЦР Mastercycler gradient фирмы Bio Rad. Параметры ПЦР 30 циклов: 94°С ЗОсек, 55°С 30 сек, 72°С 1мин. 103 После проведения ПЦР в

3.5.3. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле Для приготовления агарозного геля добавляли 0,8-1,0 г легкоплавкой агарозы к 100 мл раствора lxTBE (табл.2). Раствор прогревали в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Полученный раствор охлаждали до ~ 40-60°С, добавляли 5 мкл водного раствора бромистого этидия 1 мг/мл, перемешивали, выливали в плашку. После застывания геля вносили образцы в ячейки и проводили электрофорез при напряжений тока ~ 100-150 В. Разделение фрагментов Д

3.5.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с помощью набора реагентов для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля фирмы Thermo Scientific (GeneJET Gel Extraction Kit) согласно протоколу с использованием фирменных реагентов. Полоску агарозного геля массой —

0.10.3 мг, содержавшую нужный фрагмент ДНК, растворяли в

0.1-

0.3 мл буферного раствора Binding buffer (GeneJET Gel Extraction Kit) при 50°C до полного

3.5.5. Приготовление векторов и вставок Составляли следующую реакционную смесь: ДНК (плазмидная или ПЦР-фрагмент) 10х буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции (каталог фирмы MBI Fermentas) эндонуклеаза рестрикции 1 эндонуклеаза рестрикции 2 Н20 2 мкл Ю ед 0 или 10 ед до 20 мкл 3 мкг Полученную смесь инкубировали при 37°С в течение 2-4 ч. Добавляли 2 мкл LA раствора, наносили на агарозный гель и приводили разделение фрагментов ДНК. ДНК-фрагмент нужной длины вырезали из геля и выделяли с

3.5.6. Приготовление компетентных клеток Е. coli Свежую колонию клеток Е. coli штамма JM109 помещали в 5 мл среды LB (табл.2) и инкубировали при 37°С ночь. 1мл ночной культуры добавлялось в 300мл LB и инкубировалось при температуре 16°С при перемешивании (200 об/мин) до оптической плотности Абоо ~ 0,5. Культуру клеток выдерживали в течение 10 мин во льду, переносили в предварительно охлажденные центрифужные пробирки и осаждали центрифугированием в предварительно охлажденном роторе JA 14 при

3.5.7. Трансформация компетентных клеток Е. coli Пробирку с компетентными клетками размораживали во льду, добавляли 1-5 мкл раствора плазмидной ДНК (~ 0,1 мкг) в дистиллированной воде, инкубировали 30 мин при 0°С. Затем прогревали смесь на водяной бане в течение 40-50 сек при 42°С, охлаждали до 0°С, добавляли 800 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С. Аликвоту 10—20 мкл трансформационной смеси высевали на чашку Петри с твердой средой LB, содержавшей соответствующие антибиотики. Инкубиро

3.5.8. Выделение плазмидной ДНК для клонирования. Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора реагентов для вьщеления плазмидной ДНК GeneJET Plasmid Miniprep Kit фирмы Thermo Scientific согласно протоколу с использованием фирменных растворов. Колонию клеток штамма Е. coli, несущую определенную плазмиду, помещали в 5 мл среды LB, содержавшей соответствующий антибиотик, и инкубировали при перемешивании в течение 16 ч на 37°С. Клетки осаждали центрифугированием при 7000 об/мин 5 мин,

3.6. Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукориотические клетки Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток проводили с использованием набора реагентов для выделения плазмидной ДНК фирмы Thermo Scientific (GeneJET Plasmid Miniprep Kit). Колонию клеток E. Coli трансформированных плазмидой описанной выше в разделе

3.2.7, помещали в 100 мл среды LB, содержавшей соответствующий антибиотик, и инкубировали при перемешивании в ночь на 37°С. Клетки осаждали центрифугированием при 50

3.7. Трансфекция плазмид в эукориотические клетки и обработка клеток вальпроевой кислотой (ВПА) Трансфекцию проводили в 24-луночных плашках для культивирования клеток. Для этого смесь плазмид массой 0,5 мкг экспрессирующих hTERT и hTR, в массовом отношении 1:10 соответственно, разбавляли средой OptiМЕМ®1 Medium до объёма 25мкл. Далее разбавленная смесь плазмид смешивали с равным объемом Lipofectamine 2000, разбавленного в 25 раз средой Opti-MEM®I Medium. Полученную смесь инкубировали при ком

3.8. Экспрессия и очистка теломеразы Для экспрессии теломеразы клеточную линию НЕК293Е выращивали в среде ДМЕМ при 37°С, 5% СО2 и трансфецировали плазмидами p-DS-SFFVhTERT и pBluescript-DS-Ul-hTR. Для этого FIEK293E клетки в 10см чашке петри трансфецировали 22 иг плазмидами и Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Для этого смесь плазмид массовом отношении 1:10 соответственно (2 мкг p-DSSFFV-hTERT and 20 мкг pBluescript-DS-Ul-hTR) разбавляли средой OptiМЕМ®1 Medium до объёма 1,5 мл. Далее разбавлен

3.9. Метод измерения ингибирования теломеразы in vitro (RQ-ТРАП) Количественный RQ-ТРАП с разбавлением проводили в два этапа. На первом этапе к 5 мкл очищенной теломеразы (предварительно в 50 раз разбавленный препарат, полученный после выделения в 1х ТРАП буфере) добавили 5мкл исследуемого ингибитора в том же буфере. Смесь инкубировали Юмин при комнатной температуре, далее добавляли 5мкл mixl. Реакционную смесь инкубировали при 30°С, ЗОмин и инактивировали нагреванием на 80°С, Юмин. Затем 150

3.10. Прямой метод измерения теломеразной активности 20мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл 1 Ох теломеразного буфера, 2 мкл очищенной теломеразы, 40 мкМ dATP, 80 мкМ dTTP, 2 мкМ dGTP, 20 мкСЛ [a 32 P]-dGTP (3,000 Ci/ммоль) и 35 нМ 5'-биотинилированный теломерный праймер b-HuG3, а так же исследуемое на ингибирование активности теломеразы вещество инкубировали 45 мин при 30°С. Реакцию остановливали добавлением ЭДТА, до конечной концентрации в смеси 25 мМ. Следовые количества 5'радиоактивно

Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотида 15bpLC Реакцию проводили в 20 мкл. Реакционная смесь содержала 2 мкл 10х буферного раствора для Т4 полинуклеотидкиназы, 20 пмоль 15bpLC, 10 ед. Т4полинуклеотидкиназы (MBI Fermentas, 10 ед./мкл) и 10 пмоль [у-32Р]АТР (удельная активность 220 ТБк/ммоль или 6000 Ки/ммоль). Кинирование проводили при 37°С в течение 30 минут, после чего фермент инактивировали нагреванием в течение 15 минут при 75°С.

3.12. Трансфекция клеток ингибиторными олигонуклеотидами и получение клеточного экстракта Трансфекцию проводили на F1EK293E клетках с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в 96-луночных плашках для культивирования эукориотических клеток. Олигонуклеотды последовательно разбавляли средой Opti-MEM®I Medium до концентрации 220 мкМ, 22 мкМ,

2.2 мкМ, 220 нМ, 22 нМ,

2.2 нМ,

0.22 нМ,

0.022 нМ соответственно. В дальнейшем 5 мкл разбавленного олигонуклеотида смешивали с 5мкл

3.14. Проверка сборки теломеразы Для проверки сборки мы использовали клеточные экстракты полученные при трансфекции клеток 5мкМ олигонуклеотидами. 500 мкл 5-ти кратно разбавленного ТРАП буфером клеточного экстракта центрифугировали в сахарозном градиенте. Сахарозный 20% градиент сахарозы получали в 1х 2-х ТРАП кратным буфере. замораживанием-размораживанием Центрифугирование проводили в SW-41 Ti роторе (Beckman) при. 4°С, 20h, 111132g (30000 об/мин) в J2-HS Beckman центрифуге. Фракции по 50

3.15. Определение количества hTR с помощью метода обратной транскрипции сопряженной с ПЦР (RQ-ПЦР) К каждой фракции добавляли 2 мкл гликогена (20мг/мл, Roche Applied Science). Затем РНК экстрагировали смесью фенол/хлороформом (1:1), осаждали этанолом и растворяли в 50мкл mQ воды. Полученный раствор РНК подвергали обратной транскрипции. Реакцию проводили в объеме 10 мкл, содержащим 2 мкл 5х RT буфер,

2.5 мкл полученного раствора РНК, 1 мкМ олигонуклеотида hTR-Rl,

0.5мМ dNTP,

<

3.16. Получение hTR методом in vitro Т7-транскрипции Матрицу для Т7-трансрипции получали с помощью ПЦР (30 циклов: 40сек 94°С, 20сек 58°С, 90сек 72°С) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1нг плазмиды pBluescript-DS-Ul-hTR, lx Pfu буфера (Fermentas), 0,5 мкМ T7-hTRforward праймера,

0.5 мкМ hTR-reverse праймера,

0.2 мМ dNTP,

0.1 U Pfu полимеразы. ПЦР продукт очищали с помощью GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific). Затем РНК синтезировали с помощью MEGAScript-T7 K

3.17. Определение уровня hTR в клетках с помощью RQ-ПЦР

2.5 мкл клеточного экстракта, полученного для измерения ингибирования олигонуклеотидами теломеразы в клетке, использовали для измерения уровня hTR в клетках, трансфецированных олигонуклеотидами. Обратную транскрипцию проводили по протоколу, описанному в разделе

3.15. Мы заметили, что клеточный экстракт не влияет на обратно транскрипционную реакцию, однако ингибирует ПЦР. 7-ми кратное разбавление продукта обратно транскрипцио