Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10

Год: 2013

Номер работы: 2128

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

242 Анализ смеси стандартных аминокислот и гидролизатов биологически активных пептидов 57 58 59 59 59

243 Синтез нуклеопротеиновых конъюгатов

244 Масс-спектрометрический анализ

245 Нуклеазный гидролиз

246 ПЦР в режиме реального времени конъюгата

2.4.7. Синтез олигонуклеотидов, содержащих гексахлорфлуоренильную м е т к у . . . . . . . . . . . . 60 60 60 61 . . . . . 61 62 62 62 62 63

2.4.8. Очистка зондов методом вертикального гель-электрофореза

2.4.9. Выделение зондов из ПААГ

2.4.10. ВЭЖХ-очистка НЕХ-зондов

2.4.11. ПЦР в режиме реального времени на основе НЕХ-зондов

2.5. Статистическая обработка результатов КЭ .

2.5.1. Расчет селективности разделен

- аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации методом капиллярного зонального электрофореза. Для увеличения выхода мономеров в работе необходимо рассмотреть влияние условий пробоподготовки образцов на процессы химической деградации аминокислот; провести его верификацию на примерах анализа образцов препаратов пептидов; Научная новизна. 1. Разработана новая схема высокочувствительного анализа низкокопийных пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюг

1.1.Основные способы определения низкокопийных пептидов Одна из актуальных задач в протеомных исследованиях сегодня состоит в поиске новых биомаркеров различных, в том числе патологических, процессов, причем наиболее информативным оказывается анализ состава низкокопийных белков. Развитие инструментальных методов, в частности, высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и ПЦР-диагностикой, низкокопийных позволило и значительно провести расширить преде

Среди современных методов анализа низкокопийных биомаркеров особое значение имеет метод иммуно-ПЦР, который впервые позволил количественно определять фемтомолярные концентрации белков и пептидов в составе сложных смесей без их предварительного обогащения. Основное преимущество этого прогрессивного подхода состоит в использовании биоспецифических взаимодействий целевых молекул в сочетании с амплификацией сигнала с помощью приемов полимеразной цепной реакции. Метод иммуно-ПЦР основан на исполь

2. ДНК-аптамеры Кроме известных иммунологических подходов в качестве аффинных молекул (антител) используются специальные ДНК-аптамеры - олигонуклеотиды, селектированные по сродству к объекту-мишени. Они могут рассматриваться как один из наиболее перспективных и технологически доступных классов искусственных аналогов антител. Олигонуклеотиды—короткая нуклеотидная последовательность длиной до 20-30 нуклеотидных оснований. Нуклеотиды — звенья нуклеиновых кислот, каждый из которых состоит из аз

3.1. Принцип метода полимеразной цепной реакции Полимеразная цепная реакцияэто циклическая ферментативная реакция, в ходе которой температурозависимая экспоненциальное происходит увеличение количества копий определенного участка молекулы исходной ДНК в неограниченных количествах (рис.7). Внедрение полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое направление - ДНК-диагностику [31]. 5-й цикл 32 копии 4 коп M i l / 3-й цикл 4-й цикл Экспоненциальная амплификация / 1 копия Образец >

3.2. Компоненты реакции Для проведения полимеразной цепной реакции необходимы компоненты (рис.

8):

1) Олигонуклеотидные затравки (праймеры) пара искусственно следующие синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 18 до 24 нуклеотида, комплементарные противоположным концам разных цепей соответствующим участкам ДНК-фрагмента;

2) Taq-полимераза термостабильный фермент, сохраняющий активность после инкубации при высоких температурах и обладающ

3.3. Температурные режимы программы ПЦР «Классическая» программа ПЦР включает в каждый цикл амплификации три температурных интервала (рис.

9): 1. Денатурация ДНК. Денатурацию ДНК, находящуюся в образце, обычно проводят при 90-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. Чтобы полностью денатурировать ДНК, достаточно одной секунды инкубации при температуре 90 °С. Однако для уверенной денатурации ДНК рекомендуется 5-10 с. Сл

3.4. Оценка результатов реакции Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день являются методы горизонтального электрофореза и способы флуориметрической детекции. Метод горизонтального электрофореза основан на разделении молекул ДНК по молекулярному весу [36]. Для этого готовят пластину 1-3% агарозного геля в электрофорезном буфере основном бромистый с добавлением этидий). специального красителя ДНК (в в Продукты амплифи

3.5. Полимеразная цепная реакция е реальном масштабе времени ПЦР в режиме реального времени позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации на протяжении всего анализа. Это дает возможность определять количество исходной ДНК. Использование флуоресцентных методов детекции продуктов реакции и автоматизация метода позволяет не только повысить надежность измерения, но и упростить процедуру анализа и уменьшить время исследования за счет отсутствия отдельной стадии детекции. Помимо этого

3.6. Факторы, влияющие на количественной ДНК-диагностики позволяет провести чувствительность и достоверность Метод полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени количественный анализ содержания определенной последовательности ДНК. Он широко используется в различных молекулярнобиологических и медицинских исследованиях, например, в генодиагностике. На достоверность анализа существенно влияет концентрация праймеров в реакционной смеси, которая обычно составляет концентрации пр

3.7. Визуализация накопления ДНК при проведении ПЦР «в реальном времени» Существующие системы регистрации накопления продуктов ПЦР непосредственно во время реакции основаны на измерении флуоресценции реакционной смеси, которая была пропорциональна количеству наработанной в ходе реакции ДНК. Для того чтобы детектировать сигнал флуоресценции в системе используют как было упомянуто выше олигонуклеотидные зонды, снабженными на 5'-конце флуорофорами. Их способность поглощать свет в диапаз

3.8. Типы зондов в специфических системах детектирования Специфичные регистрировать системы детектирования фрагмента ДНК позволяют строго достоверно определенной накопление последовательности. Все специфические системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием в реакционной смеси меченого олигонуклеотида (или нескольких олигонуклеотидов), неспособного выступать в качестве затравки и комплементарного уникальной части амплифицируемой последовательности. Меченый олигонуклеотид может быть прик

Для того чтобы увеличить скорость реакции, были объединены праймер и гибридизационный зонд в одну молекулу. Для этого к 5'- концу праймера прикрепили зонд со структурой типа «шпилька», в котором петлевая часть комплементарна внутренней части олигонуклеотидной мишени (рис. 16). Скорпион (Зонд+ ПЦР праймер) ПЦР праймер ПЦР а мпл ифика ция Целевая посяеОователъностъ » • Внутримолекулярная гибридизация f-ч^ . . Детектируемая ^ г т ^ . флуоресценция \>^ зМ^ Рис. 16. Схема работы праймер

В данном подходе используют зонд, представляющий собой пару комплементарных друг другу олигонуклеотидных зондов, один из которых несет флуорофор, а другой - нефлуоресцентный гаситель (рис. 17). В отсутствие мишени зонды гибридизованы между собой, что приводит к низкому уровню флуоресценции. При наличии мишени ДНК, один из зондов образует более устойчивое соединение с комплементарной последовательностью мишени. Это способствует разделению зондов и увеличению уровня флуоресценции. В качестве

3.8.3. Линейные зонды (TaqMan) В этом случае олигонуклеотид метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В свободном состоянии зонд может образовывать «случайный виток», в котором флуорофор и гаситель сближены. Это позволяет подавить сигнал флуоресценции по механизму флуоресцентнорезонансного переноса энергии. В течение ПЦР зонд гибридизуется на ампликон одновременно с праймерами, и во время удлинения последних Taq- полимеразой происходит разрушение зонда за счет 5'-экзонуклеазной акт

Зонды по типу «молекулярные маячки» в растворе при температурах ниже 55-60 °С образуют жесткую структуру типа «шпильки» с очень низким уровнем флуоресценции. Флуорофор и гаситель располагаются по концам олигонуклеотида. Данные зонды несут на 3'- и 5'- концах короткие (5-8 пар нуклеотидов) взаимнокомплементарные области, называемые «ножками». Олигонуклеотидная последовательность петли (область между «ножками» зонда) состоит из 15-30 нуклеотидных остатков, которые комплементарны последовате

3.8.5. Примыкающие пробы В данной методике используют два олигонуклеотида, гибридизующихся с матричной ДНК в непосредственной близости друг от друга. Один из олигонуклеотидов несет флуорофор-донор на 3'-конце, другой - флуорофоракцептор на 5'-конце. Гибридизация двух олигонуклеотидов с матрицей ведет к сближению флуорофоров и переносу энергии с донора на акцептор, при этом регистрация сигнала происходит из-за уменьшения флуоресценции донора и увеличения флуоресценции акцептора (рис. 20). При

Первым шагом на пути к установлению аминокислотного состава служит гидролиз всех пептидных связей чистого пептида. При гидролизе кислотой или щелочью наблюдается частичная или даже полная потеря некоторых аминокислот. В общепринятых условиях исчерпывающего гидролиза (6 М НС1, 24 часа, 110°С) полностью разрушаются триптофан, глутамин, аспарагин, частично теряются серии, треонин и тирозин. Цистеин и метионин частично разрушаются или окисляются до цистеиновой кислоты и метионинсульфоксид

1.2.2. Методы разделения и анализа аминокислот В настоящее время основными методами анализа АК являются хроматографические методы: ионообменная хроматография [85, 86, 87, 88], высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [89, 90], тонкослойная хроматография (ТСХ) [91], газовая хроматография (ГХ) [92, 93], а также капиллярный электрофорез (КЭ) [94]. Как правило, в процессе анализа свободные АК подвергают либо пред-, либо постколоночной дериватизации. В первом случае производные получают

Поскольку аминокислоты в водном растворе являются заряженными частицами, то становится возможным их разделение методом КЭ. В отличие от используемых хроматографических методов разделения АК, КЭ не требует применения дорогостоящих токсичных реактивов и позволяет осуществить анализ свободных аминокислот на микроуровне, что ведет к уменьшению стоимости определения [104]. Кроме того, КЭ сочетает эффективность разделения, простоту аппаратурного в себе высокую оформления, высокую точность количе

2.2. Приборы и оборудование Капиллярно-электрофоретический анализ с фотометрическим детектированием осуществляли на приборах «Нанофор 01» (ИАнП РАН, СанктПетербург, Россия) и Model 270А (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, США). Электрофореграммы, полученные на приборе Model 270А записывали с использованием двухканального Амстердам, Нидерланды). самописца Model BD 41 (Kipp & Zonen, полученные на приборе Электрофореграммы, «Нанофор 01», записывали и обрабатывали с использование

Необходимые рабочие растворы готовили растворением определенной навески или объема вещества в точно известном объеме растворителя известного состава. В случае растворов с известным рН его значение контролировали с помощью рН-метра. Ниже приведены рабочие буферные растворы и методики их приготовления. Все растворы предварительно подвергали фильтрованию через 0,22 мкм мембраны Millipore (Франция) и перемешивали с помощью ультразвуковой или магнитной мешалки. 150 мМ фосфат натрия, 20% об. мет

2.4. Общая методология работы

2.4.1. Приготовление кислотных гидролизатое природных пептидов Пластиковые и стеклянные поверхности используемых всех пробирок и сосудов, для гидролиза пептидов, в целях очистки последовательно обрабатывали детергентом, водой, ацетоном. Не рекомендуется для очистки стекла использовать хромовую смесь из-за возможного образования продуктов окисления, остающихся на поверхности. После приготовления в пробирке (Eppendorf) реакционной смеси и тщательного перемешивания, раствор переносили в специа