Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Диагностика лазерно-индуцированных структурных изменений в хрящевой ткани методом спекл-интерферометрии : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.04, 02.00.09

Год: 2007

Номер работы: 60274

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

. в связи с бурным развитием новых методов лазерной коррекции формы хрящей и лазерной регенерации межиозвоночных дисков и суставных хрящей увеличивается разрыв между практическим применением этих методов и фундаментальными исследованиями. Решение этой проблемы лежит в области междисциплипарных исследований и требует проведения дополнительных исследований. В настоящее время для коррекции формы перегородки носа, межнозвоночных дисков, гииертермии опухолевых регенерации новообразований успешно

.

. Действие ИК лазерного излучения на хрящевую ткань приводит к ее термическому нагреву и вызывает протекание множества физико- химических процессов, таких как денатурация, дегидратация, диффузия и испарение внутритканевой воды. Хрящ - это сложный объект для исследования. Тем не менее, в нем можно выделить два основных структурных компонента - протеогликановую и коллагеновую трехмерные надмолекулярные структуры - сетки. Лазерный нагрев может вызывать структурные изменения в этих компонентах,

1.1.1. Состав хрящевой ткани. Хрящевая ткань - одна из разновидностей соединительной ткани, относящаяся к группе тканей опорной функции. Характерными особенностями соединительных тканей являются малое количество клеток (около 1% по массе), отсутствие нервов, и практически полное отсутствие кровеносных сосудов. Хрящевая ткань содержит специализированные метаболически активные клетки, хондроциты, интегрированные в межклеточный матрикс, который, в свою очередь, образован коллагеновыми волокнам

1.1.2. Структура и денатурация коллагена II в хряще. Как уже отмечалось выше, из органических веществ матрикс гиалинового хряща наиболее богат коллагеном (от 50 до 70% сухого веса в зависимости от источника ткани). Коллаген - основной белок (точнее семейство белков) соединительной ткани, составляющий около 30% сухого веса тела млеконитающих. Существуют коллагены разных типов (I-XX), наиболее распространенными являются фибриллярные коллаген I (кожа, сухожилия связки, фибриллярный хрящ) и колл

1. Определение содержания коллагена биохимическими методами. в образцах ткани Оценка степени денатурации коллагена при умеренном ИК лазерном нагреве является ключевым при проведении термических экснериментов на хрящевой ткани. В силу сложности строения биологической ткани очень важно разработать методику определения коллагена нечувствительную к другим компонентам тканп, которые могут внести в методику измерения существенную ошибку. Как уже отмечалось выще, коллаген имеет специфические мар

1.2. Влияние лазерного ИК нагрева на иротеогликановую подсистему и выделение воды. Движение воды в хрящевой ткани играет важную роль, так как из-за отсутствия в ней сосудов именно за счёт диффузии внутритканевой воды с растворёнными в ней питательными веществами происходит питание хряща. Также вода помогает обеспечивать необходимые механические свойства хрящевой ткани: она вытесняется из участка, испытывающего давление, возвращаясь в него после прекращения воздействия [52]. В настоящее время

1.3. Взаимодействие лазерного излучения с биологическими тканями.

1.3.1. Распределение энергии при лазерном облучении биологических тканей. Цель лазерного облучения - ввести энергию излучения в локальный объем ткани и стимулировать в нем требуемые фотохимические или тепловые процессы, даюшие благоприятный медицинский эффект. Для решения этой задачи во многих случаях лазерное излучение не имеет альтернативы. Однако следует учитывать, что значительная часть энергии света отражается, рассеивается, или проходит сквозь целевой участок ткани. На рисунке 7 схемат

2. Виды лазерного процессов. воздействия по типу инициируемых

Лазерный луч с достаточно большой энергией фотонов (например, в УФ - области спектра) может инициировать в биологических тканях цепь химических превращений, которые способны вызывать как позитивные, так и негативные отклики организма. К негативным явлениям обычно относят неунравляемое генерирование свободных радикалов. Полагают, что они могут оказывать мутагенное и канцерогенное действие [71]. В работе [72] экспериментально показано, что УФ - излучение ArF эксимерного лазера (к = 193

нм

. Тепловое воздействие лазерного излучения на биологические ткани основывается на поглощении излучения и преобразовании его энергии в тепло. Эффект зависит как от температуры, так и от длительности воздействия. В таблице 2 приведена классификация реакций биологической ткани на её нагрев в зависимости от температуры. Стоит отметить, что указанные температуры соответствуют равновесным процессам, протекающим при медленном нагреве. При температуре до 45°С не ожидается каких-либо необратимых повр

1.3.3. Виды лазерного воздействия на биоткани по интенсивности.

. Обработка тканей и органов в режиме низкоинтенсивного воздействия не нриводит к существенным изменениям структуры тканей, поскольку температура ткани повышается всего на несколько градусов. Такое новышение температуры приводит к стимуляции клеточной деятельности и ренарационных воспалительных процессов. процессов Авторы в [77] отмечают хряще уменьшение после коленном свиней низкоинтенсивной обработки Пе-Ne лазером. Гистологические исследования показали, что носле лазерного воздействия п

Режим лазерной обработки ткани, при котором доза лазерного излучения ниже порога абляции, называется субабляционным. Субабляционное лазерное воздействие на биологические ткани отличается от низкоинтенсивного тем, что в нем средняя температура биологической ткани повышается на несколько десятков градусов. В субабляционном режиме осуществляются термотерапия (43 - 60°С), гипертермия (60 - 100°С), остановка кровотечения (60-150°С), термопластика хрящей и коллагенсодержащих тканей (65 - 75°С) [6

. При достаточно высокой интенсивности лазерного излучения органические компоненты биологической ткани механически разрушаются под действием импульса давления, создаваемого паром, и распадаются на атомы и молекулы под действием высокой температуры (пиролиз). Описанный процесс называется лазерной абляцией биологической ткани. При импульсной абляции [83,84] вместе с перегретым материалом из ткани удаляется и большая часть тепловой энергии, а ее незначительный остаток приводит к минимальным т

1.4. Метод спекл-интерферометрии. В носледние время исследователи уделяют все большее внимание моделированию химических и экснериментальному изучению динамики физико- процессов, происходящих в биологических тканях при мехапических и термических воздействиях. Повышенный интерес к ним в основном связан с развитием термических лазерных технологий для медицины. Наиболее перспективными для изучения динамических нревращений в биологических тканях являются онтические методы. Они обладают рядом ха

1.4.1. Когерентность: пространственная и временная. При когерентном освещении случайно-неоднородных объектов, таких, например, как шероховатая поверхность или прозрачная среда с флуктуирующим в пространстве ноказателем преломления, в рассеянном поле формируется спекл-структура. Снекл-структура (англ. speckle — крапинка, нятнышко) — это случайная интерференционная картина, которая образуется при взаимной интерференции когерентных волн, имеющих случайные сдвиги фаз и/или случайный набор интенс

1.4.2. Формирование спеклов в дальней зоне дифракции. Рассмотрим некоторые оптические схемы наблюдения спекл-картин в дальней зоне дифракции, представляющих собой результат интерференции когерентных волн от отдельных неоднородностей поверхности объекта. На рисунке 8,а представлен фрагмент спекл-структуры. Рисунок 8. Спекл-картина в поле дифракции лазерного пучка на шероховатой поверхности (а) и различные оптические схемы наблюдения спекл-картин (б, в). 1 - источник света, 2 - случайно-неодн

1.4.3. Дифракция и спеклы. Снекл-структура несет информацию о свойствах объекта, на котором рассеялся свет лазера. При этом следует разделять два типа снекл-нолей: развитое и частично-развитое. Первый тин, развитое снекл-поле наблюдается при дифракции широких лазерных пучков на силъношероховатой новерхности или сильнорассеивающем случайном транспаранте. При этом нредполагается, что если число неоднородностей освещенного участка поверхности достаточно велико, то комплексная амплитуда рассеянн

. Спеклы, наблюдаемые при отражении от биологических тканей (биоспеклы), очень сложны для изучения в силу сложности структуры наблюдаемого объекта - биологической ткани. Тем не менее, движение биоспеклов может быть представлено как сумма двух более простых движений: смещение и «кипение». Полезно ввести специальное понятие «фазовый экран» для описания поведения биоспеклов. Под фазовым экраном понимается совокупность одинаковых рассеивателей, для которых можно предполагать, в общем случае, схож

1.4.5. Статистические функции описания спеклов. В работе [91] для экспериментального описания спеклов, формирующихся в дальней зоне дифракции при интерференции «гауссовых» пучков, были приведены три метода по анализу статистических функций методы, основанные на анализе декорреляционной, автокорреляционной и кросскорреляционных функций. Декорреляционная функция имеет выражение: о "• ('.>•('.) где / - интенсивность, k и п - номера спекл-картин в общей последовательности спекл-картин.

1.4.6. Использование оптоволоконного жгута для передачи спеклкартин. При изучении спеклов важным становится способ доставки изображения. Иногда необходимо передавать спекл-картины из трудно доступных зон (полость носа, суставная сумка). Для этого удобно применять оптические жгуты, какими обычно пользуются для передачи изображения в эндоскопии. Оптический жгут состоит из множества тонких оптических волокон, каждый из которых независимо передает интенсивность света с входной поверхности жгута

Глава 2. Спекл-интерферометрический анализ состояния вещества нри нагреве.

. В настоящее время метод спекл-интерферометрии широко используется для измерения скоростей рассенвателей, находящихся в приповерхностном слое, для регистрации трансформаций поверхности и изменений её микрорельефа, которые могут быть вызваны, как внутренними массопереносамн (например, ток крови в капиллярах), так и механическими пли акустическими воздействиями. Тем не менее, несмотря на большой объем публикаций, посвящепных развитию и примепепию метода спеклинтерферометрии, и на имеющиеся, в

2.2. Схема экспериментальной установкн.

2.2.1. Общая аппаратная схема. Для проведения и последующего обсчета экспериментальных результатов была разработана специальная схема автоматического сбора и обработки информации, позволяющая в режиме реального времени связать все приборы и организовать систему обратной связи. Рисунок 16. Схема экспериментальной установки. 1,10,11, компьютеры; 2, ПЗС камера; 3, система линз с диафрагмой; 4, He-Ne лазер; 5, ИК-зеркало; 6, система линз с поляризатором света; 7, ИК нагревающий лазер; 8, образ

.

При изучении динамики спеклов биологических тканей, образец фиксировался в сиециальном держателе, который предотвращал изменение формы ткани или её движение, что было необходимо для нивелирования влияния механических деформаций и движения на статистику спекл-картин.

. Для формирования снекл-структур в отраженном свете поверхность образца облучалась когерентным источником света - He-Ne лазером {\ = 632,8 нм, Uniphase 1135Р, Р = 20мВт), излучение которого проходило через систему линз и поляризатора, что было необходимо для линейной поляризации лазерного излучения и увеличения зоны облучения (освещения) на поверхности образца. Для обеспечения равномерного освещения исследуемого участка ткани старались добиться как можно более широкой зоны облучения (8x8 м

Рисунок 19. ПЗС камера Sony XCD-V50. Отраженный от образца свет He-Ne лазера фиксировался ПЗС камерой Sony XCD-V50 (разрещение 640 х 480 пикселей, 60/30/15 Гц, 8/14-бит, монохромная, Япония) или ПЗС камерой «ВИДЕОСКАП» VS-CTT-075-2001 (разрещение 752 х 582 пикселей, 25 Гц, 8-бит, монохромная, Россия). ПЗС камера регистрировала спекл-картины с передачей их на персональный компьютер, что позволяло производить параллельно расчет в режиме реального времени в случае реализации системы обратной св

Оптическая система регистрации спеклов была сконфигурирована для наблюдения спеклов в дальней зоне дифракции, в зоне Фраунгофера, в соответствии с ниженриведенным неравенством: где Я - длина волны падающего излучения, z - расстояние между плоскостью рассеяния и плоскостью наблюдения, d - размер освещенного участка поверхности. Для этого между ПЗС камерой и образцом была установлена систем линз с диафрагмой для увеличения передаваемого изображения (уменьщение параметра d) и оптического пути

. Рисунок 20. Волоконный эрбиевый лазер ЛС-1,56 (ИРЭ "Полюс"). Для нагревания биологической ткани использовался управляемый с компьютера оптоволоконный эрбиевый лазер ЛС-1,56 (^ = 1560 нм, «ИРЭПолюс», Россия) или неуправляемый с компьютера Nd:YAG лазер New Star Model 130 (А. = 1320 нм, США). Выбор данных лазеров был обусловлен тем, что они дают умеренный нагрев биологической ткани в приповерхностном слое. [1]. Показатель поглощения ^eff в биологических тканях для заданной длины

2.6. ИКрадиометр. Рисунок 22. Термовизионная камера ИРТИС-200. ^б'ОО /f. V<7tf^ \ — — — 5(Н) К 4(Н)К 3(К)К 200 к КЮК оо JC Рисунок 23. Графики зависимостей спектральной плотности энергетической яркости потока (Ц) и фотонной спектральной плотности энергетической яркости потока теплового излучения (L''x,) от длины волны для черного тела при различных температурах. Прерывистая линия на обоих графиках указывает местоположение максимумов для температурных кривых через каждые 10К (сами к

. Паряду с представленной выше схемой экспериментальной установки (Рис.

16) использовали модифицированную схему, куда был включен оптический жгут. Между жгутом и изучаемой иоверхностью образца помещали линзу, с помощью которой изображение поверхности образца передавалось на плоскость входного торца оптического жгута. Выходной торец жгута располагался на расстоянии примерно 12-15 см от плоскости ПЗС матрицы камеры (Рис. 26). -о Рисунок 26. Модификация экспериментальной установки с вклю

2.2.3. Расположение и временная синхронизация. Все приборы запускались одновременно для обеспечения временной синхронизации по сигналу с программного таймера или с внешнего триггера. Зона облучения лазеров совпадала с зоной наблюдения камер как в случае нагрева биологических тканей, так и в случае нагрева чистых белков или низкомолекулярных органических соединений и имела размер 2x2 мм., что соответствовало размеру зоны наблюдения 200x200 пикселей (размер зерна - 0,01

мм) на кадрах ПЗС

.

. Сбор информации производился со всех камер в исходном необработанном формате, который конвертировался в набор интенсивностей, в режиме реального времени с сохранением на компьютер. Для ИК камер дополнительно переводили значения интенсивностей в температуры по экспериментально определенной градуировке. Значения интенсивностей, регистрируемые ПЗС камерами, использовались для расчетов статистических функций спекл-картин, таких как контраст, среднее значение интенсивности, кросскорреляционный

. Спекл-картины (Рис. 16), регистрируемые ПЗС камерой, использовались для расчета статистических функций спекл-картин, таких, как средняя интенсивность света, контраст (автокорреляционная функция), кросскорреляционный коэффициент Пирсона (декорреляционная функция). Среднее значение интенсивности рассчитывалось по уравнению: Где <Ik> - значение средней интенсивности для кадра.А:, h - значение интенсивности в точке кадра к с координатами {т,п). Для вычисления функции контраста пользова

2.3.3. Расчет интегральной приповерхностной температуры. При обработке температурных следующую процедуру:

1) определяли точку с максимальной температурой;

2) вокруг точки с максимальной температурой определяли сто самых горячих точек-соседей для зоны сканирования размером 20x20 пикселей (2x2

мм);

3) полученный набор из ста значений температур усредняли для получения усредненной температуры Тк, где индекс к соответствует номеру кадра ИК камеры. Предложенная процедура оп

2.4. Методика проведения спекл-интерферометрического анализа. В предыдущих частях настоящей главы были описаны схема расположения и настройки оборудования, критерии выбора расстояний между элементами, цифровая обработка результатов. Тем не менее, в силу сложности проведения спекл-интерферометрического анализа и высокой чувствительности спеклов к различным щумам было важно вести контроль поведения статистических функций на протяжении всего эксперимента, так как анализ этих функций позволяет и

Глава 3. Динамика сиеклов ири нагреве иизкомолекулярных соединений и белков.

. Нагрев вещества вызывает протекание ряда физико-химических процессов, среди которых можио выделить такие недеструктивные процессы, как фазовые переходы первого рода - плавление, испарение, и тепловое расширение (сжатие), которые, в свою очередь, могут приводить к модификации объема и трансформации поверхности. Эти процессы приводят к изменениям оптических свойств матрикса вещества, оптических свойств и числа рассеивающих частиц (центров) в глубине и в приповерхностном слое изучаемого объек

. Следующие химические вещества и белки использовались для анализа их плавлеиия и денатурации методом сиекл-интерферометрии:

1) коричная кислота (транс) (CAS 140-10-3) со степенью чистоты 98% с температурой плавления в районе 131-136°С и кипепия - ~ 300°С;

2) акриламид (CAS 79-06-1) со степенью чистоты 99,9% с температурой плавления в районе 82-86°С и точкой возгонки при ~ 138°С;

3) бычий сывороточный альбумин (CAS 9048-46-8) со степепью чистоты 96%;

4) бычий коллаген

. При проведении спекл-интерферометрического анализа использовали методику, приведенную в главе 2 настоящей работы. Образцы нагревались на электрической плитке по линейному закону с заданной скоростью. Во время нагрева производилась регистрация спекл-картин ПЗС камерой с передачей данных на компьютер. Расчет статистических функций производился по алгоритму, приведенному в главе 2 настоящей работы. Рисунок 39. Фрагмент спекл-структуры поверхности акриламида до начала плавления. Рисунок 40.

Глава 4. Динамика спеклов ири ИК лазерном нагреве хрящевой ткани.

. В последние время уделяется все большее внимание моделированию и экснериментальному изучению динамики физико-химических процессов, происходящих в биологических тканях при механических и термических воздействиях. Повышенный интерес к ним в основном связан с развитием лазерных технологий для медицины. Наиболее перспективными для изучения динамических преврашений в биологических тканях являются оптические методы. В данной работе изучалась возможность применения метода спекл-интерферометрии дл

.

. Исходным материалом служил гиалиновый хрящ носовой нерегородки. Ткани были изъяты у телят или поросят в возрасте до 12 месяцев. Хрящевая ткань очищалась от надкостницы и рыхлой соединительной ткани. Хрящи выделялись в день проведения эксперимента и хранились при 4°С в физиологическом солевом растворе. Известно, что такой способ использования сводит к минимуму денатурацию коллагена, вызванную естественными процессами разложения при длительном хранении. Выделенные хрящи нарезались на тонки

4.2.2. Хрящевая ткань без нротеоглнкановой нодснстемы. Интактная хрящевая ткань носовой перегородки телят или поросят была подвергнута ферментативной обработке 0,1 % раствором трипсина в инкубационном буфере с целью удаления протеогликановой компоненты. Обработке подвергали образцы хрящевой ткани весом около 50 мг при соотношении фермент/субстрат 1:20 в течение 20 часов при 37°С. Состав инкубационного буфера:

0.1М трисгндрохлорид (TrisHCl), 25mM ЭДТА, 5000 единиц пенициллина и 5 мг стре

4.3. Анализ коллагена биохимическим методом. Аминокислотный анализ основан на онределении содержания гидроксинролина - иминокислоты, специфичной для коллагена (содержание ~ 13,3 % от сухого остатка).

4.3.1. Предварительная подготовка образцов. Определение степени денатурации коллагена основывалось на особенности воздействия трипсина на коллагеновое волокно. Известно, что трипсин гидролизует только денатурированные или поврелсдённые молекулы коллагена, однако, нативные молекулы коллагена не подаются гидролизу и остаются нетронутыми ферментом трипсин из-за конформационных затруднений. Следствием этого является невозможность образования фермент-субстратного комплекса. После облучения хря

4.3.2. Анализ гидроксипролина. Анализ был основан на проведении снектрофотометрической реакции взаимодействия окисленной формы гидроксинролина с реактивом Эрлиха, Структура гидроксипролина содержит в себе пирролидиновое кольцо, снособное к окислительному дегидрированию в пиррольное. Окисленная форма гидроксипролина впоследствии определялась с помощью реакции взаимодействия с реактивом Эрлиха (образуется окрашенная хиноидпая структура).

. Приготовление стандарта гидроксипролина. 25 мг гидроксипролина растворяли в 250 мл 10-3 N НС1. Отбирали 80 [хл полученного раствора и доводили до объема нробы - 4 мл. 2 мл пробы шли на приготовление образца с содержанием гидроксипролина 4 цг/2 мл. Оставшиеся 2 мл пробы разбавляли в два раза и вновь отбирали 2 мл на приготовление образца с содержанием гидроксипролина 2 цг/2 мл. Аналогичным образом нолучали образцы с содержанием гидроксипролина 1 цг/2 мл и

0.5 цг/2 мл. Стандарт с содерж

К образцам и стандартам нрибавляли но 1 мл раствора хлорамина-Б, энергично встряхивали и выдерживали 20 мин нри комнатной темнературе. Затем добавляли по 1 мл раствора хлорной кислоты, неремешивали и выдерживали 5 мин нри комнатной температуре. После этого приливали по 1 мл раствора реактива Эрлиха, тщательно перемешивая, и выдерживали 20 мин нри 60-70 °С. Полученные окрашенные растворы разбавляли в два раза этилцеллозольвом и определяли их оптическую плотность в 10 мл-вых по кюветах нри длин

4.3.3. Определение степени депатурацпи. По результатам аминокислотного анализа сунернатантов и твёрдых остатков рассчитывали долю денатурированного коллагена но формуле: а(%)=т(Нур)с„т/( т(Нур)с„т+ т(Нур)™о) где т(Нур)снт - количество гидроксипролина в сунернатанте, а т(Нур)тво - количество гидроксинролина в твёрдом остатке ткани носле обработки ферментом. Общая схема биохимического онределения стенени денатурации нредставлена на рисунке 46. Шразсц ткани Тройкая спираль Деиа7урмрпвянимй Л I

. Термический анализ препаратов проводили методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с использованием сканирующего калориметра (DSC 30, Mettler ТА 4000, Швейцария), Образцы герметично закрывали в стандартных алюминиевых тиглях (40|il), образцом сравнения служила аналогичный пустой тигель. Калибровку осуществляли по теплоте плавления индия. Начальная, конечная температура и скорость нагрева для калориметрического исследования хряща составляли 0°С, 100°С, 10 К/мин соответственно.<

4.5. Результаты и обсуждение.

4.5.1. Динамика сиеклов при диффузии и испарении воды в биологических тканях в процессе ИК лазерного нагрева. Как уже отмечалось выше, при нагреве биологической ткани происходят диффузия и испарение воды. Это может приводить к изменению спекл-картин и их статистики. При анализе литературы не были обнаружены научные данные по статистике спекл-картин при диффузии или испарении воды. Поэтому было необходимо провести исследование для выяснения характера чувствительности статистики спекл-картин к

4.5.2. Динамика спеклов при ИК лазерном нагреве хрящевой ткани, обработанной трипсином. В хрящевой ткани белок коллаген образует трехмерную надмолекулярную рещетку - сетку. Денатурация коллагена приводит к структурным изменениям в трехмерной коллагеновой сетке. Поэтому эти структурные изменения обязательно найдут отражение в изменении статистики спекл-картин. При анализе литературы не были обнаружены научные данные но статистике спекл-картин при структурных изменениях трехмерных надмолекуля

4.5.3. Динамика спеклов при ИК лазериом иагреве интактиой хрящевой ткани. Необходимо было сопоставить результаты экспериментов изучения динамики снеклов при нагреве интактной хрящевой ткани с уже полученными результатами экспериментов, в которых изучалась динамика спеклов при диффузии, испарении воды и денатурации коллагена в хрящевой ткани, обработанных тринсином, с разрущенной протеогликановой подсистемой. Данное исследование было проведено впервые и позволило установить основные факторы,