Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Дизайн, конструирование и изучение свойств поли-CTL-эпитопного Т-клеточного иммуногена - кандидата ДНК-вакцины против ВИЧ-1/СПИД : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71655

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Актуальность проблемы Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и его возбудитель, вирус ВИЧ-1, были открыты более 20 лет назад, и сейчас это заболевание продолжает распространяться по всему миру, охватывая как развитые, так и в развивающиеся страны. По данным ВОЗ общее количество заболевщих в мире достигло уже более чем 40 млн. человек. Из них только в 2005 году около 5 млн. человек стали вновь инфицированными (http://www.unaicls.org). СПИДа. Паиболее эффективным средством предотвращения

1.1. Молекулярная биология ВЖЧ-1 Вирус иммунодефицита человека был выделен в 1983 году групной профессора Люка Монтанье из лимфатического узла больного СПИДом в Парижском институте Пастера [21]. В том же году в США группа профессора Роберта Галло выделила вирус из лимфоцитов периферической крови больных СПИДом [22,23]. Оба выделенные вируса оказались идентичными и ВОЗ в 1987 году приняла единое название - "вирус иммунодефицита человека". Вирус иммунодефицита человека нервого типа (В

Вирус иммунодефицита человека является этиологическим агентом СПИДа. В настоящее время этот вирус, а также множество вакцинных конструкций и стратегий их применения против ВИЧ достаточно хорошо охарактеризованы и изучены. Вместе с этим проблема профилактики и лечения СПИДа остается нерешенной, так как существующие вакцины являются пока еще мало эффективными. По последним данным ВОЗ сейчас в мире

40.3 млн. человек живут с вирусом ВИЧ-1. Из них взрослых - 38 млн., детей -

2.3 млн. У

Высокая частота генетической изменчивости ВИЧ [41] - важнейший аспект, который нужно учитывать при создании вакцины против СПИД. Эта изменчивость очевидна на уровне даже одного инфицированного организма, и (несоизмеримо выше на глобальном популяционном уровне). Из-за того, что механизм репликации вируса работает не точно, новые мутации вносятся (виртуально) в каждый, вновь образующийся вирион. Из-за того, что каждый день в организме инфицированного могут синтезироваться миллиарды уникальных

1.2.2. Проблемы тестирования вакции Отсутствие адекватных экспериментальных моделей для изучения инфекции, вызываемой ВИЧ-1, является одной из причин, сдерживающих разработку и тестирование вакцины против ВИЧ-1. ВИЧ-1 является членом обширного семейства лентивирусов приматов. Несколько видов африканских нечеловекообразных приматов эндемично поражаются видоспецифическиими вирусами, известными как simian immunodeficiency virases (SIV) [54]. Интересно, что эти SIV обычно не вызывает заболевания

Создание вакцины против ВИЧ-1 требует ясного понимания механизмов иммунного контроля репликации ВИЧ-1. Размножение ВИЧ-1 у пациентов с острой инфекцией протекает следующим образом. Резкий «взрыв» размножения происходит в течение нескольких недель после заражения. В последующие недели почти всегда сохраняется частичная репликация вируса. Это ограниченное ингибирование вирусного распространения является следствием частично успешного антивирусного иммунного ответа. Исследованы иммунные механизмы

1.2.4. Механизмы иммуиосупрессии и имуннопатологии при ВИЧ-инфекции Серьезным препятствием создания ВИЧ-1 вакцины является способность вируса и его отдельных компонентов индуцировать механизмы иммуносупрессии и иммунонатологии. Один из механизмов иммуносупрессии, индуцируемый ВИЧ-1, вызывает серьезные нарушения баланса между ТЫ и Th2 хелперами, что существенно снижает иммунный ответ, вызываемый инфекцией. Отсюда следует, что перспективная вакцина должна индуцировать иммунный ответ, который я

1.3. Традиционные стратегии вакцинации Стратегии вакцинации, основанные на живых аттенюированных вирусах, инактивированных вирусах и рекомбинантных белках успешно себя зарекомендовали для защиты человека от многих вирусных патогенов. Однако, эти стратегии не эффективны в случае ВИЧ-1.

1.3.1. Стратегии вакцинации, основанные на иснользовании аттенуированного вируса Многие вирусы могут мутировать, проходя пассажи на клеточных культурах таким образом, что остаются инфекционными, но теряют свой патогенный потенциал. Как пример эффективных аттепюированных вирусов можно упомянуть вакцины против оспы, кори и полиомиелита. Данные, полученные на обезьянах, показывают возможность защиты от SIV инфекции обезьян, инфицированных аттенуированным вирусом SIV [88]. Обширные делеции в опр

1.3.2. Стратегии вакцинации, основанные на нснользовании инактивироваикого вируса Физически или химически инактивированные вирусные иммуногены обеснечивают эффективный иммунитет в случае вируса гриппа и полиомиелита. Инактивированная вирусная вакцина создана против SIV у обезьян [91]. Однако иммунитет ограничен очень узким кругом вирусных изолятов, против которых ноявляется защита. Более того, продолжительность иммунитета, вызванного инактивированным вирусом, была достаточна мала. Вакцины т

1.3.3. Стратегии вакцинации, осиоваииые иа исиользовании рекомбинантиых вирусиых белков Другой подход к дизайну вакцип основан на использовании рекомбинантных вирусных белков, кодируемых в составе вирусных [93] или бактериальных [94] векторов, или нуклеиновых кислот [95]. Однако использование полноразмерных вирусных антигенов для создания рекомбинаптных вакцин осложняется несколькими проблемами. Во-первых, создание надежной вакцины требует использования большого числа рекомбинантпых антигенов

1.4. Новые нетрадиционные стратегии вакцинации, осиоваииые иа использовании синтетических полиэннтониых иммуногенов Согласно современным представлениям, один из наиболее перспективных подходов к созданию нового поколения надежных и безопасных вакцин основан на идентификации Ти В-клеточных эпитопов внутри белковых антигенов ВИЧ-1 и создании на их основе полиэпитопных вакцин [105,106]. Такие вакцины должны быть лишены недостатков, которые присущи субъединичным вакцинам, а также вакцинам, разраб

1.4.1. Системы доставки вакцинных конструкций на основе использования плазмидиой ДНК В 1997 г Donnelly J.J. с соавторами показали, что внутримышечная инъекция плазмиды, содержащей вирусный ген под контролем промотора вызывает как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ у лабораторных животных [107]. На нечеловекообразных приматах такая стратегия оказалась безопасной и эффективной (имеется ввиду наличие именно CTL ответа) [108]. В доклинических испытаниях на человеке показано, что плазмидн

Живые рекомбинантные бактерии и вирусы, несущие гены, кодирующие антигены ВИЧ-1, также используются, как потенциальные ВИЧ-вакцины. В качестве примера использования живых векторов можно упомянуть вирус вакцины, аттенуированные штаммы сальмонелл и туберкулезную вакцину BCG [122,123]. Так как эти сконструированные вирусы и бактерии размножаются в организме, то и иммунитет вырабатывается и на сам вектор и на продукт генов ВИЧ-1. В силу того, что эти вакцины живые, то и иммунный ответ имеет как

1.4.3. Дизайн полиэпитопных иммуногенов Как уже отмечалось, одним из наиболее перспективных подходов к созданию нового поколения надежных и безопасных вакцин основан на идентификации Ти Вклеточных эпитопов внутри белковых антигенов ВИЧ-1 и создании на их основе полиэпитопных вакцин [105,106]. При этом необходимо учитывать, что технологии конструирования Ти В-клеточных иммуногенов принципиально различаются. Для стимуляции ВПЧ-специфических антител важное значение может иметь пространственная

1.4.4. Синтез генов, кодирующих полиэиитопные иммуногены Создание ДНК-вакцинных конструкций, кодирующих искусственные полиэпитопные иммупогены, требует использования современных методов синтеза протяженных молекул ДНК. Исторически первыми исследователями, которые начали синтезировать гены были Khorana с соавторами [151,152]. Они осуществили тотальный синтез генов TRXA. Itakura с соавторами впервые провели синтез гена (включая регуляторные области) и успешно экспрессировали соматостатин [153

Как уже отмечалось, одной из причин, сдерживающих создание вакцины против ВИЧ-1, является отсутствие адекватных экспериментальных моделей. В настоящее время только шимпанзе, ближайшие родственники человека, могут быть инфицированы ВИЧ-1. Однако эти животные вряд ли являются нодходящей моделью для изучения ВИЧ-инфекции. Поэтому в настоящее время акцент делается на использование экспериментальных моделировать ВИЧ-инфекцию на моделей других SIV и SHIV, non-human которые позволяют Понимание при

Задача изучения иммуногенности вакцинных кандидатов несколько упрощается, так как в данном случае могут также использоваться мелкие животные, в частности, мыши. Однако при использовании экспериментальных моделей для тестирования иммуногенности CTL-вакцины, содержащей эпитопы, рестрнктированные молекулами ПЬА I класса, необходимо, чтобы в состав вакцины были включены дополнительные CTL-эпитопы, распознаваемые и представляемые молекулами МЫС I класса мышей и обезьян. В качестве примера можно пр

Заключение по обзору литературы Основываясь на современных данных, можно сделать вывод, что безопасная и эффективная вакцина против СПИДа должна удовлетворять следующим требованиям:

1) Вакцина должна вызывать индукцию специфических антител. Индуцируемые антитела должны быть специфичны как к вариабельным, так и наиболее консервативным эпитопам и обладать вирус-нейтрализующей активностью, блокируя инфекционность различных изолятов ВИЧ непосредственно в местах их размножения. Вакцина не д

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Клетки, илазмиды, ферменты, питательные среды, олигонуклеотиды В работе использовали бактериальные штаммы Escherichia соИ JM109 (recAl, endAl, gyrА96, thi-\, hsdRll (Гк" ш^, supE44, relAl, X, Mlac-prok, B), [F' traD96,proA, B, /acIqZAM15]), AD494(DE3) (Novagen, США) из коллекции ГНЦ ВБ "Вектор", векторные плазмиды pFH123 [173]; pBK-RSV (Stratagen, США), pcDNA

3.1(-)/mycHis/LacZ (Invitrogen, США), pET32a (Novagen, США) и pGEX-4T-l Швеция), эндонуклеазы рестрикции, Т4-

2.2. Экснрессня гена TCI в клетках E.coli Для доказательства экспрессии гена TCI в клетках E.coli были сконструированы рекомбинантные плазмиды рЕТ-ТС1 и pGEX-TCI, которые получали клонированием гена TCI (в виде ^аотШ-^Л-фрагмента плазмиды pFH-TCI) в векторных плазмидах трЕТ32а/ВатШ-SaIl и pGEX-4T-l/ВamRl-Sall, соответственно (в полилинкер рЕТ32а нредварительно вставили синтетический фрагмент ДНК, кодирующий последовательность из 6-ти остатков гистидинов для аффинной хроматографии на NiNTA ага

Трансфекцию COS-клеток проводили при достижении 60-70% монослоя. В пробирку типа Eppendorf помещали 200 мкл среды ДМЕМ (Биолот, Россия), 5 мкл плазмидной ДНК pcDNA

3.1.

-TCI и 5 мкл липофектамина (Sigma, США). Смесь тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. После инкубации смесь вносили к культуре клеток и помещали культуральный планшет в СОг-инкубатор на 4 часа. Затем в каждую лунку добавляли 1 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% фетальную бычью

2.4. Анализ экспрессии гена по определепию сиптеза специфической мРНК Выделение суммарной РНК проводили из 10^ COS клеток, трансфецированных плазмидой pcDNA-TCI, с использованием набора фирмы Qiagen, по инструкции, рекомендуемой фирмой-изготовителем. Получение кДНК проводили в реакции обратной транскрипции с использованием ревертазы (Биосан, НИВХ СОРАН) и полиdT олигонуклеотидов. Далее полученную кДНК использовали для проведения ПЦР с использованием специфических праймеров к целевому гену. У

2.5. Получепие поликлоиальиой сыворотки к белку TRX-TCI Беспородные кролики были трехкратно иммунизированы очищенным белком TRX-TCI в дозе 100 мкг/животное внутримышечно с интервалом две недели. Титры антител контролировали через каждую неделю. Сыворотки с максимальными титрами собирали и использовали для иммуноблот-гибридизации рекомбинантных белков.

ИФА выполняли на 96-луночных полистироловых планшетах («Енисей», Красноярск). Раствор исследуемых белков (1 мг/мл) был сорбирован по 100 мкл/лунку с разведением 1:100, 1:200, 1:500. В качестве положительных контролей использовали фрагменты белков ВИЧ-1, входящие в состав коммерческих тест-систем ЗАО «ВекторБест» (Кольцово, Новосибирской обл.), в качестве отрицательных контролей были использованы индивидуальные белки GST и TRX и лизат клеток Е.соИ. Образцы клеток Е.соИ, экспрессирующих белки

2.7. Получение плазмиды для клонирования гена TCI в эукариотической системе Для клонирования гена TCI в эукариотической системе использовали вектор pcDNA

3.1(-)/myc-His/LacZ (Invitrogen, США). Для того чтобы экспрессия целевого гена TCI была наиболее оптимальной, во-первых, был удален плазмидный фрагмент, содержащий прокариотический промотор и участок /acZ-гена Е.соИ и, во-вторых, перед стартовым ATG-кодоном введена консенсусная последовательность Kozak. Полученная рекомбинантная плазми

Для исследования иммуногенности полученных вакцинных конструкций использовались мыши BALB/c весом 10-12 г из питомника лабораторных животных ГНЦ ВБ «Вектор». Иммунизацию плазмидными конструкциями pcDNA-TCI проводили инъекцией препаратов внутримышечно в задние лапы в отсутствии адыованта. Для иммунизации использовали две дозы (20мкг и 100 мкг) плазмидной ДНК. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в две недели. Забор крови и спленоцитов для определения титров антител (ИФА), пролифератив

2.9. Определение нролиферации Т-лимфоцитов Антиген-специфическую реакции бласттрансформации Т-клеточную пролиферацию оценивали с помощью спленоцитов иммунизированных и контрольных животных по общепринятому методу [178]. У иммунных животных на указанные сроки после иммунизации проводилась эвтаназия методом цервикальной дислокации. В асептичных условиях извлекалась селезенка, которая гомогенизировалась. Полз^енные спленоциты двукратно отмывали центрифугированием в среде культивирования (среда

2.10. Определение титров аитител с иомощью ИФА В качестве антигенов для проведения ИФА использовали белок TCI и смесь рекомбинантных белков Gag и Env вируса ВИЧ-1. В работе использован 96-луночный планшет CORNING. Антиген в концентрации 1 мкг/лунку и в объеме 50 мкл адсорбировали 15 часов при 4^0. Для титрования использовали разведение сывороток, начиная с 1:10 до 1:2560. В работе использован коньюгат антител кролика против IgG мыши с пероксидазой хрена («Sigma», США).

2.11. Определение

3.1. Дизайн искусственного иммуногена, содержащего множественные CTLэинтоны основных антигенов ВИЧ-1 Известно, что ВИЧ-1 индуцирует CD8'^ CTL ответы путем представления своих антигенов совместно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, МНС) I класса на поверхности инфицированных клеток. При этом вирусные антигены распознаются специфическими Т лимфоцитами не как полноразмерные белки, а как короткие пептиды (8-12 а.о.), ассоциированные со специфическ

Первичная структура гена TCI и соответствующая ей аминокислотная последовательность представлена на рис. 9. Для синтеза искусственного гена длиной 1176 пар оснований был реализован блочный способ сборки из трех предварительно синтезированных блоков ДНК. При этом блоки I, II, III были спланированы таким образом, что первый кодирует эпитопы из Gag, второй - из Env, и третий - из Pol и Nef. Синтез фрагментов I, II и III осуществляли комбинированием матричного и безматричного синтеза методом ПЦР

3.3. Конструирование рекомбииаитных плазмид для эксирессии гена TCI в нрокариотической и эукарнотической системах

3.3.1. Получение рекомбинантных нлазмид, экспрессирующих ген TCI в E.coli Конструирование экпрессирующей нлазмиды рЕТ-ТС1 Для получения рекомбинантной плазмиды рЕТ-ТС1 плазмиду рЕТ-32а (Novagen) гидролизовали последовательно эндонуклеазами рестрикции ВатШ и Sail в стандартных условиях. Вектор pET32a/BamHI-SalI выделяли пассивной элюцией из 4% полиакриламидного геля. Bam-Sal фрагмент гена TCI с 5'-выступающими липкими концами получали путём гидролиза плазмиды pFH-TCI теми же рестриктазами с о

3.3.2. Получение рекомбинантной нлазмиды, экснрессирующих ген TCI в эукариотической системе Для клонирования гена TCI в эукариотической системе использовали вектор pcDNA

3.1(-)/myc-His/LacZ (Invitrogen, США). Для того чтобы экспрессия целевого гена TCI была наиболее оптимальной, во-первых, был удален плазмидный фрагмент, содержащий прокариотический промотор и участок /acZ-гена E.coli и, во-вторых, перед стартовым ATG-кодоном введена консенсусная последовательность Kozak. С этой целью ве

Чтобы доказать, что целевой ген экспрессирует эпитопы ВИЧ-1, ген TCI был клонирован в клетках Е.соИ в составе экспрессирующих векторов pGEX-2T и рЕТ-32а (рис. 11-12). Антигенные свойства искусственного белка TCI, связанного как с GST, так и TRX белками, были исследованы в ИФА с использованием панели ВИЧ-1 позитивных сывороток больных (10 образцов) и панели ВИЧ-1 негативных человеческих сывороток (10 образцов донорской крови). Оба химерных белка 100% выявлялись на панели позитивных сывороток

Для оценки иммуногенности плазмидной ДИК, кодирующей поли-CTL- эпитопный иммуноген TCI использовалась рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI. При этом исследовали следующие параметры иммунного ответа: ответ CTL, пролиферативный ответ лимфоцитов и титры антител. 1 2 3 4 5 2 4 2 4 A Б В Рис. 15. Электрофорез и иммуноблот-гибридизация белков GST-TCI и TRX-TCI A. Электрофорез в 13% полиакриламидном геле: 1 - лизат клеток Е.соН, несущих плазмиду pGEX-TCI; 2 - очищенный белок р24 ВИЧ-1; 3 - лиза

3.6.1. Оценка количества цитотоксических Т-лимфоцитов иммунизированных животных Ответ CTL оценивали по выявлению IFN-у-продуцирующих лимфоцитов в реакции ELISPOT. Полученные результаты представлены в рис. 16. Анализ иммуногенности конструкций позволяет сделать следующие выводы. Во-первых, плазмидная ДИК, кодирующая белок TCI способна индуцировать специфические CTLs у иммунизированных животных в ответ на стимуляцию спленоцитов in vitro как полноразмерным белком ТС1, так и отдельными эпитопам

3.6.2. Оценка пролиферативной активности снленонитов иммунизированных животных Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по реакции бласттрансформации. Анализ полученных в ходе проведенного эксперимента результатов свидетельствует о том, что спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, обнаруживают прирост пролиферации как на белок TCI, так и на пептиды N15 и N16 по сравнению с пролиферацией контрольной группы животных, иммунизированных векторной нлазмидой pcDNA

3.1 (рис. 17).

3.6.3. Исследование титров антител в сыворотках крови иммунизироваииых животных После ДНК-иммунизации животных рекомбинантной плазмидой pcDNA-TCI титры антител оценивали в реакции ИФА с использованием ряда антигенов, в том числе белка TCI, смеси рекомбинантных белков Gag и Env, а также лизата вируса ВИЧ1 (см. рис. 18). Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1) При иммунизации мышей плазмидой pcDNA-TCI происходит наработка специфических антител, которые связываются как