Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71646

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. На территории Российской Федерации с периодичностью раз в три-четыре года происходят эпидемические вспышки заболеваний, вызываемых хантавирусами, а Республика Башкортостан является одним из самых крупных в мире районов-очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), Возбудителями ГЛПС являются вирусы рода Hantavirus (семейство Bunyaviridae), которые подразделяются на несколько различных серотипов. По данным литературы в настояш;ее время насчитывается

глава 2), результатов исследования и их обсуждения (

глава 3), заключения, выводов и сниска цитированной литературы, включающей 184 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 112 страницах и содержит 28 рисунков, 8 таблиц. Основные результаты диссертации изложены в 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с иочечным синдромом Хантавирусы вызывают у человека тяжелые инфекционные заболевания - геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный кардио-пульмонарный синдром (ХКПС). ГЛПС характеризуется системным поражением мелких сосудов, геморрагическим диатезом, гемодинамическими расстройствами и своеобразным поражением ночек (Пиконоров и др., 2001). Основным резервуаром вируса в природе являются мышевидные грызуны. Кроме т

возбудителей заболевания ГЛПС

1.2.1. Соответствие различных серотипов хантавирусов определенным хозяевам-переноечикам. Впервые вирус, вызывающий тяжелую форму геморрагической лихорадки был изолирован в 1976 г. Но Wang Lee (Lee et al., 1976) из серых полевых мышей Apodemus agrarius, которые были отловлены близ реки Хантаан. В 1982 г. был обнаружен непатогенный серотип Prospect Hill, изолированный из луговых мышей Microtus pennsylvanicus, пойманных в США (Lee Р. et al., 1982). В начале 80-х г.г. в Корее из диких крыс Ratt

1.2.2. Особенности органнзацнн генома хантавирусов Род Hantaviras входит в одну из самых крупных групп животных вирусов, семейство Bunyaviridae. Хантавирусы обладают характерными для данного семейства чертами. Вирусные частицы сферической формы, с диаметром от 90 до 120 нм. Вирионы хантавирусов имеют липидсодержащую внешнюю оболочку с поверхностными выступами, представляющими собой вируспецифичные гликопротеины, которая окружает три кольцевых нуклеокапсида диаметром 2-2,5 нм. Хантавирусы ин

1.2.3. Синтез вирусной РНК и созревание вирионов Для вирусов с негативным геномом, каким является хантавирус, характерно то, что геномная РНК вынолняет две матричные функции: вопервых, для транскрипции и, во-вторых, для репликации, поскольку геномная "минус" РНК хантавирусов не может функционировать в качестве транслируемой мРРЖ. Для синтеза мРНК вирусный геном должен соответствующие транскрибироваться, и, носкольку в клетках хозяина ферменты отсутствуют, в вирионе хантавируса зак

Начальные этапы транскрипции и репликации РНК хантавирусов в соответствии с механизмом "праймирования-выравнивания" (Garcin et al., 1995). До дальнейшей элонгации РНК праймер "выравнивает" три нуклеотида на матрице таким образом, что гуанин на конце хозяйского праймера оказывается в гуанин положении затем оставляя -1. отщепляется Неспаренный полимеразо- трифосфорилированный ассоциированной эндонуклеазой, монофосфорилированный урацил (5'-mU) в позиции +1 5'-конца

Антигенные антигенов свойства хантавирусов белка и обусловлены антигенов наличием нуклеокапсидного поверхностных гликопротеинов, вызывающих образование вируснейтрализующих антител. При исследовании свойств различных антител к вирусу Puumala было выявлено, что нуклеокапсидный белок вызывает образование антител, не способных нейтрализовать инфекционную активность, тогда как поверхностные гликопротеины стимулируют образование нейтрализующих антител (Деконенко, Ткаченко, 2004), Использова

1. Метод флуоресцирующих антител Метод флуоресцирующих антител (или иммунофлуоресцентный анализ (Кирней, 1989)) - это метод иммунофлуоресценции, который V проводится для изучения антигенных и генетических взаимоотношений хантавирусов либо на криостатных срезах легочной ткани диких грызунов, либо на монослое клеток Vero Е6, инфицированных вирусом. В прямом МФА флуоресцентным красителем (обычно флуоресцеин изотиоцианатом) метятся антитела, узнающие вирусный антиген. В непрямом МФА, который исп

Этот метод отличается от МФА только тем, что вместо пероксидаза хрена. После флуоресцентной инкубирования метки антител используется с пероксидазой с исследуемым образцом, добавляется субстрат для пероксидазы, который изменяет цвет при воздействии на него фермента. Достоинство метода состоит в том, что просматривать образцы можно в обычный микроскоп. Еще больше данный метод подходит для проведения иммуноанализа на срезах тканей параллельно с гистологическим анализом, что позволяет

Обнаружение специфических антител в физиологических жидкостях организма играет важную роль в клинической диагностике широкого круга заболеваний как инфекционного, так и аутоиммунного характера. Методы ИФА - это разнообразные и широко использующиеся методы, которые могут применяться для детекции антигенов независимо от того, находится ли антиген в растворе, или связан с клеточной поверхностью. Непрямой иммуноферментный анализ используется для обнаружения и количественного определения антител

За последние пять лет были разработаны и получили высокую оценку иммунохроматографические тесты для острой хантавирусной инфекции. Эта методика основана на горизонтальной иммунодиффузии с применением в качестве антигена высокоочищенного нуклеокапсидного белка PUU хантавируса, экспрессируемого бакуловирусами (Hujakka et al., 2001а). После добавления исследуемого образца (сыворотки, плазмы или крови) и буфера, PUU-специфические иммуноглобулины М, если они есть, в течение 5 минут вместе с анти-и

5. П о л и м е р а з н а я ц е п н а я р е а к ц и я В с п л е с к активности исследований в области изучения хантавирусов произошел в 80-е годы, когда в различных лабораториях мира были усовершенствованы и адаптированы применительно к хантавирусам более современные и эффективные средства, чем непрямые иммунофлуоресцентные и иммуноферментные методы. Таким мощным и чувствительным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Преимущества ПЦР приобрели особое значение именно в отношении

5.1. ОТ-ПЦР, "гнездовая" ОТ-ПЦР Диагностика ГЛПС с использованием обратной транскрипцииполимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) является высокочувствительным Ф методом ранней диагностики, К сожалению, этот метод не применяется в широкой практике в связи с отсутствием коммерческих а м п л и ф и к а ц и о н н ы х диагностических систем, а тест-система, разработанная в н а ш е й стране (Яшина с сотр., 2004), не освоена в п р о м ы ш л е н н о м масштабе. Как у ж е было отмечено выше, опре

5.2. ПЦР в реальном времени Метод ОТ-ПЦР уже более 10 лет используется для детекции и генетической характеристики хантавирусов (Childs et al., 1994; Nichol et al,, 1993; Puthavathana et al,, 1992; Rowe et al., 1995; Xiao et al., 1992, 1994; Dekonenko et al, 1997; Plyusnin et al., 1997, 1999; Papa et al., 1998). Для идентификации вируса Пуумала (Garin et al., 2001) так же, как и для других вызывающих геморрагическую лихорадку вирусов Эбола, Марбург, Ласса, вирусов геморрагической лихорадки Кр

. Помимо полимеразной цепной реакции, существует еще и лигазная цепная реакция (ЛЦР), которая известна гораздо меньше, но имеющая при этом в плане диагностики ряд преимуществ перед ПЦР. Прообразом ЛЦР можно считать работы Landegren с соавт. (1988), и Wu с Wallace (1989). Первая работа была названа авторами "Лигазно опосредованная методика детекции генов", в которой они показали принципиальную возможность дискриминировать замены нуклеотидов, приходящиеся на места состыковки двух с

2.1. Краткая характеристика объекта исследования В качестве объекта исследования была использована кДЬЖ Sсегмента геномной РНК хантавируса CG-32/Moscow-95 (серотип Puumala), клонированная в нлазмиде pCR II, имеющая высокий уровень сходства по нуклеотидной последовательности с одним из геновариантов (Ufa

97.11), обнаруженным на территории РБ во время вспышки заболевания ГЛПС в 1997-98 гг. Для выделения вирусной РНК использовали отдельные пассажи культуры клеток Vero Е6, зараженных инфекц

2.2. Выделение и очистка илазмидной ДНК ^j^ Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). Колонией E.coli, несущей плазмиду, засевали 100 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина или другие необходимые антибиотики (12,5 мкг/мл тетрациклина для штамма XL 1-Blue), и выращивали при 37°С со встряхиванием в течение ночи. Наращивание продолжали до достижения оптической плотности, соответствующей концентрации 2-3-10 клеток/мл (обычно 14 - 16 ч). Затем клетки осаж

2.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК в недеиатурирующих А условиях Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК осуществляли используя 10-12%-ные полиакриламидные гели. Источниками питания служили приборы фирмы Bio-Rad (США) модели 250/

2.5 или модели ЕС-103 (Е-С Apparatus Corporation, США). Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах подводного типа GNA-200 (Pharmacia, Швеция) или аналогичных приборах с различными размерами гелевых пластин (стандартная - 14

2.4. Выделение и очистка РНК из аутоисийных тканей # Тотальную РНК выделяли из тканей одного из погибших вследствие заболевания ГЛПС в 2004 г. экстракцией смесью гуанидинтиоционатфенол-хлороформ (Chomczynski et al., 1987). Кровь лизировали добавлением буфера, содержащего 4 М гуанидинтиоционат, 25 мМ цитрат натрия (рН=7,0), 0,5 % саркозил, 0,1 М 2-меркаптоэтанол. Затем к лизату добавляли 0,1 объема 2 М ацетата натрия, рН=4,0; 1 объем водонасыщенного фенола и 0,2 объема смеси хлороформ-изоами

ДЬЖ, комнлементарную вирусной геномной РНК (кДРЖ) получали при помощи фермента AMV-ревертазы (обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц) (Frohman, 1988). Реакцию проводили при 42°С в течение 1 час. Реакционная смесь содержала 1-2 мкг РНК, 10 пмоль праймера (HV1, HV11, HVl-long, HV71, HV72 или их флуоресцентно меченые аналоги), 1-кратный буфер (50 мМ трис-НС1 (рН=8,3), 10 мМ MgCb, 10 мМ ДТТ, 0,5 мМ спермидина), по 500 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов Ш и 5 единиц фермента (AM

2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени Амплификацию вирусной кДНК проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). К 29 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис-НС1 (рН=8,8), 2,5 мМ MgCb, 0,01% твин-20, 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 2 единицы Tth-полимеразы, по 5-6 пмоль каждого из праймеров, добавляли 1 мкл кДНК хантавируса. Амплификацию проводили на амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ фирмы BioRad (США) в 0,2 м

2.7. Фоефорилирование 5'-коицов олигонуклеотидиых праймеров Фосфорилирование олигонуклеотидов (по 1 о.е. каждого) проводили с помощью фермента Т4 полинуклеотидкиназа (2 ед. акт.) и 1 мМ АТФ в 100 мкл реакционной смеси, содержащей также 20 мМ трис-НС1 (рН=7,5), 10 1^ мМ MgCb, 1 мМ спермидина. Реакцию проводили в течение 30 мин при 37°С, фермент удаляли однократной депротеинизацией смесью фенолхлороформ (1:1) и после центрифугирования верхний водно-солевой слой осаждали 3 объемами этанола. Пос

2.8. Получение одинарных и двойного олигонуклеотндных дунлексов и А онределенне нх темнератур нлавления Для получения контрольных молекул в виде двойных дуплексов олигонуклеотиды HV1, HV3 и фосфорилированные олигонуклеотиды НУ2ф и НУ4ф в количестве по 0,01 о.е. (но 4 мкл) каждого смешивали в микроцентрифужной пробирке и нагревали до 85°С, затем медленно охлаждали до комнатной температуры. Образовавшиеся одинарные дуплексы типа 1/4 и 2/3 лигировали в конечном объеме 20 мкл в буфере следующег

2.10. Компыотериый аиализ иуклеотидных последовательностей Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы " DNASTAR, Inc." (США). Нуклеотидные последовательности S-сегментов хантавирусов b были взяты из опубликованных статей и посредством Интернета в обновляемых версиях "GenBank". #

Рестриктазы: Hpall ("MBI Fermentas", Литва) ДНК-лигаза фага Т4 (Pharmacia, Швеция) АТФ (Serva, ФРГ) Трис (гидроксиэтиламинометан) "Trizma" или "Sigma 7-9" (Sigma, США) ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль) (Serva, ФРГ) Дрожжевой экстракт, Бакто-пептон, Бакто-агар, Бакто-тринтон (Difco, США) ф Ампициллин, тетрациклин (Serva, ФРГ) Полиэтиленгликоль 6000 (Fluka, Швейцария или Merck, ФРГ) Агароза для электрофореза ДНК (Bio-Rad, США) Агароза для

2.12. Составы нснользованных стандартных растворов среда LB бакто-триптон (1%), дрожжевой экстракт (0,5%), NaCl(l%) агаризованная среда LB бакто-триптон (1%), дрожжевой экстракт (0,5%), NaCl (1%), агар-агар (1,5%) среда TYP бакто-триптон (1,6%), дрожжевой экстракт (1,6%), NaCl (0,5%), К2НРО4 (0,25%)

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Реакции с ДНК (плазмида pCRH)

Филогенетический анализ, проведенный на основе компьютерного выравнивания первичных в структур S-сегментов банке вирусной РНК, зарегистрированных электронном нуклеотидных носледовательностей GENBANK (NCBI, США), показал, что изоляты, выделенные на территории Республики Башкортостан занимают на соответствующей дендрограмме несколько обособленное положение от хантавирусных штаммов, выделенных примерно в те же годы в других этим, при разработке регионах территории России (рис. 1). В связи

3.1.2. Проверка плазмиды pCRII на наличие вставки. В ходе экспериментов нами были проведены модельные реакции с различными режимами, разными матрицами, праймерами, концентрациями всех реагентов. В качестве первой матрицы для ПЦР была использована плазмидная ДНК. Это плазмида pCRII, в которой клонирована кодирующая область S-сегмента вируса геморрагической лихорадки штамма CG- 32/MOSCOW-95. Для проверки пригодности данной матрицы была проведена стандартная ПЦР с праймерами S1 и S2 (табл. З.1.

3.1.3. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времепи При выборе схемы и параметров ранее в ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ методом руководствовались сближенного разработанным лаборатории расположения праймеров на мишени, пригодного для использования их как в ПЦР, так и в ЛЦР (рис

3.2,

3.3). 129 пн HV7 HVl HV2 кДНК 32 пн Рис.

3.2. Схема расположения праймеров по отношению к матрице и их нумерация. Если в процессе ЛЦР используются все 4 праймера, два из ко

Схема образования целевых гетеродуплексов в цепных лигазной (А) и полимеразной (Б) реакциях с переносом резонансной энергии от FAM к ROX или с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I. HV4) - другой, то для проведения ПНР достаточно двух праймеров (HVH-nV3). Рассчитанная температура плавления продукта ПЦР/ЛЦР длиной 32 П составляет

75.8°С при

37.5% GC-nap, а температура отжига Н праймеров - 42-47°С в стандартных условиях (табл.

3.2). Таблица

3.2. Прай

нараметрами реакций С подобранными условиями проводились полимеразная и лигазная цепные реакции. Важным моментом является подбор концентрации матрицы и праймеров. Избыточная концентрация матрицы, применяемая в модельных экспериментах, приводит к ухудшению разрешающей способности реакций ПЦР и ЛЦР. При высоких концентрациях праймеров стимулируется образование димерных продуктов, приводяших к регистрации ложного сигнала в образцах, не содержащих искомой матрицы. С помощью варьирования концен

Удлиненные праймеры с флуоресцентной меткой, использованные для амплификации плазмидной ДНК. Наименование праймера HV11-FAM HV31-R0X HV72-FAM HV31-R0X Ориентация праймера Ч НуклеотидПоследовательность ная позиция 283, 303 304, 325 186,206 304, 325 5 '-aggcttaggTatggaaatgtc-3' 5 '-gtcaatggcaTttacatcaag-3' 5 '-gagaagaaTggcagatgcagt-3' 5 '-gtcaatggcaTttacatcaag-3' праймера ПЦР продукт (ПН) i» (( 42 (( а 129 Рис.

3.7. Элекрофореграмма продуктов ПЦР с «удлиненными» праймерами. 1

3.2. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР на синтетнческой матрице

3.2.1. ПЦР с SYBR Green I и FAM-ROX Для постановки модельных экспериментов РТ-ПЦР в реальном времени был синтезирован 35-звенный рибоолигонуклеотид HVIRNA (ЗАО «CPfflTOJI», Москва), соответствующий консервативному участку S- сегмента РНК хантавируса штамма CG-32/Moscow-95 (серотип Puumala): 5'-UGGCAUUUACAUCAAGGACAUUUCCAUACCUAAGG-3' Синтез кДЬЖ проводили с помощью различных праймеров: HV1, HV1-FAM или HV11-FAM (рис.

3.9.)

3.3. ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК

3.3.1. Реакции с построепием кДНК Для подтверждения результатов, полученных при использовании плазмидной и синтетической матриц, были взяты образцы РНК, выделенные из культур клеток Vero Е6, зараженных вирусом ГЛПС, крови больных ГЛНС и легочной ткани грызунов-переносчиков ГЛПС. РНК выделяли с помощью TRIZOL и хранили при -20°С под изопропанолом (табл.

3.5). Таблица

3.5. Концентрации РНК, выделенной из различных образцов. Номер образца Название образца Концентрация РРЖ, Hg/

1.1. ОТ-ПЦР с ST-poI. Все выделенные образцы РНК (табл.

3.5) были использованы для проведения ПЦР с построением кДНК. Образцы РНК, выделенные из грызунов, были разведены в 70 раз, чтобы приблизительно уравнять концентрацию всех образцов. Для построения кДНК и проведения НЦР использовалась ST-polymerase (Single Tube polymerase) фирмы «Силекс», которая представляет собой смесь, состоящую из M-MLV обратной транскриптазы и Taq-полимеразы. Носле стадии построения кДНК с немеченым праймером H

. Чтобы проконтролировать правильность результатов, полученных в экспериментах, описанных в разделе 3,

3.1.1., мы провели опыт с отдельным построением кДНК с помощью M-MLV-ревертазы фирмы «Силекс». Для наглядности в реакцию взяли праймеры разной длины: HV1-FAM/HV3ROX и HV11-FAM/HV31-R0X. В качестве матриц для построения кДНК были взяты образцы РНК №JVbl, 4, 9, 12. Отжиг праймеров проходил при 32°С, видимо, этим можно объяснить появление неспецифических полос, в 9 из 12 образцов (рис.

Установленная по литературным данным способность некоторых ДНК-лигаз осуществлять реакцию лигирования при использовании в качестве матрицы молекулы РЬЖ (Wu, Wallace, 1989; Luo et al., 1996; Nilsson et al., 2000) стимулировала нас на определение возможности протекания лигазной цепной реакции непосредственно на РЬЖ-матрице. Это позволило бы исключить при проведении реакции стадию обратной транскрипции.

3.3.

2.1 ЛЦР на РНК (четыре праймера) Реакцию ЛЦР проводили в том же режиме, но без стадии обратной транскрипции, с праймерами HV1-FAM, HV3-R0X, НУ2ф и НУ4ф, с Tthлигазой, Taq-лигазой и Т4 ДНК-лигазой, в качестве матрицы использовали рибоолигонуклеотид HVIRNA. М_ 1 2_3. 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 SO 52 54 Cycle Рис.

3.22. Результаты ЛЦР-РВ на РНК с четырьмя праймерами. А - динамика накопления продуктов амплификации. Б - электрофоретический анали