Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Ксиланаза Penicillium Canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71643

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

Ксиланаза А

3. Клонирование гена, кодирующего мажорную эндо-1,4-бетаксиланазу РепШШит canescens

3.1.2. Определение структуры ху/^

3.1.4. Сравнение свойств ксиланазы, производимой однокопийным и мультиконийным штаммами

3.1.5. Индукция синтеза ксиланазы мицелиальным грибом Р. canescens

3.1.6. Влияние суперпродукции ксиланазы на продукцию других внеклеточных ферментов

Ксиланаза В

Клоннрованне гена Р. canescens, коднрующего регулятор транскринцнн кснланолнтнческнх генов

3.3.1. Анализ геномной ДНК Р. canescens и клонирование гена

3.3.2. Влияние делеции и амплификации х//?/? па продукцию ксиланазы рост штамма 67 75 77 79 81 85 85 и 87 5

3.3.3. ?оль xlnR в регуляции продукции других ферментов

3.3.4. Транскрипция л:/«/? 90 92 Выводы Список литературы

Введение. Человек давно использует ферменты мицелиальных грибов для обработки различного сыр

1.1 Структура полисахаридов растительных клеточных стеиок. Основными компонентами клеточных стенок растений являются целлюлоза, гемицеллюлозы, пектин, лигнин и некоторое количество белка. Целлюлоза, гемицеллюлозы и пектин являются полисахаридами, лигнин образован ароматическими мономерами [34,157]. В различных тканях содержание каждого из этих компонентов значительно варьируется. Например, содержание целлюлозы в зрелых волосках хлопчатника доходит до 95%, в зрелой древесине - 30-50%, а в к

. Целлюлоза является основным строительным материалом растительных клеточных стенок. Она состоит из линейных цепей, образованных Р-1,4 связанными остатками D-глюкозы (рис.

1.1), то есть является Р-1,4-0-глюканом. Степень полимеризации целлюлозы может доходить до 14 тысяч. Обычно, в клеточных стенках находят две фракции целлюлозы, различающихся степенью полимеризации: для одной фракции эта величина меньше 500, для другой - колеблется между 2500 и 4500 [128]. Полисахаридные цепи целлюлоз

Химическая структура целлюлозы. В гидролизе целлюлозы участвуют четыре класса ферментов [7, 20]: эндо-1,4-(3-О-глюканазы

3.2.

1.4) экзо-1,4-Р-В-глюканазы (экзоцеллобиогидролазы, или целлобиогидролазы, КФ

3.2.

1.91) экзо-1,4-Р-глюкозидазы (1,4-Р-О-глюкан-4-глюкогидролазы, КФ

3.2.

1.74) 1,4-Р-0-глюкан(1,4-р-О-глюкан-4-глюканогидролазы, КФ - целлобиазы

3.2.

1.21) (р-глюкозидазы или p-D-глюкозид-глюкогидролазы, КФ Схематически общий путь гидро

. Лигнин является аморфным гетерополимером с трехмерной сетчатой структурой. Мономером лигнина хвойных растений является конифериловый снирт, лиственничных - конифериловый и синаповый, травянистых - конифериловый и п-кумаровый [4] (рис.

1.3а.). Основные типы химических связей, возникающих в лигнине представлены на рис.

1.36., всего их насчитывают до 15 [8]. Подробное рассмотрение структуры лигнина и расщепляющих его ферментов - выходит за рамки данного обзора, отметим только, чт

. Гемицеллюлозы - это собирательное название, объединяющее полисахариды клеточных стенок растений, и не являющихся целлюлозой, пектином, камедями, слизями и крахмалом. Их отличительной особенностью является способность легко растворяться в разбавленных растворах минеральных кислот при кинячении[19]. Основными мономерами гемицеллюлоз являются D-ксилоза, D-галактоза, D-манноза, D-глюкоза, Lфукоза, L-арабиноза, L-рамноза, D-галактуроновая и 4-0-метил-0- глюкуроновая кислоты (рис.

1.4). Ча

3.1. р-Глюканы. В злаковых растениях обнаружены линейные нолисахариды, образованные смесью Р-1,3- и Р-1,4- связанных остатков глюкозы. Обычно группы из двух или трех р-1,4-глюкопиранозных остатков чередуются с одним Р-1,3-глюкопиранозным остатком [128].

3.2. Ксилоглюкан. Ксилоглюкан является составной частью клеточных стенок двудольных и однодольных растений, однако представлен в них в разных количествах: в двудольных он составляет около 20% полисахаридной фракции, а в одподольных только 2% [128]. Главная цепь ксилоглюкана образована остатками P-D-глюкозы, соединенными 1- 4 связями. К части глюкозных остатков в положение 0-6 присоедипены остатки a-l-D-ксиланопиранозы (рис.

1.5). В свою очередь к некоторым остаткам ксилозы

. Пектин является сложным гетеронолисахаридом, содержащим две сруктурно различающиеся области [102, 138]. Первая, линейная область, образована а-1,4связанными остатками D- галактуроновой кислоты, которая может быть ацетилированна в 0-2 или 0-3 положение, или метилирована в положение 0-6. Вторая, разветвленная область, в свою очередь, также состоит нз двух частей: ксилогалактуронана, образованного полигалактуроновой главной цепью с D-ксилозными заместителями, и рамногалактуронана I. В гл

1.2. Ксиланазы мицелиальных грибов. Ксиланазы, наряду с другими внеклеточными гликолитическими ферментами, производятся многими мицелиальными грибами при росте на питательных средах, содержащих растительные остатки в качестве источника углерода. Далее мы рассмотрим основные физические и химические свойства некоторых грибных ксиланаз, их классификацию, и структуры кодирующих их генов,

1.2.1. Молекулярная масса. Согласно литературным данным, молекулярные массы ксиланаз, производимых мицелиальными грибами, колеблются от 8,5 до 83 кДа (табл, 1,1). Однако, в ряде случаев величины, полученные по данным гель-фильтрации, оказывались значительно ниже величин, полученных по данным денатурирующего электрофореза в ПААГ и рассчитанных исходя из аминокислотной последовательности белка (табл. 1,1), Кроме того, мы не нашли данных о клонировании генов, кодирующих ксиланазы размером

1. Температурный и рН оптимум грпбпых ксплапаз, грибных классификация. Темнературный онтимум для большинства ксиланаз находится в диапазоне 40 - 60 °С, однако обнаруживаются штаммы как с пониженным температурным оптимумом до 25 °С [86], так и с повышенным до 75 °С [91] и 90 °С [142]. Термостабильность большинства ферментов находится в том же температурном диапазоне, что и их темнературный онтимум. Максимальную активность и стабильность большинство грибных ксиланаз нроявляют в слабокислой

1.2.3. Субстратная специфичность н нродукты расщенлення. Как было упомянуто ранее, ксиланазы расщепляют главную цень ксилана до ксилоолигосахаридов. У ферментов из разных организмов наблюдаются различия в размере продуктов расщепления, в активности по отношению к замещённым основаниям, в наличие побочных активностей. Например, две низкомолекулярные ксиланазы А. niger (pi 8,6 и 9,0) активнее гидролизуют растворимый ксилан (содержащий большое количество заместителей), чем нерастворимый (с малы

. У многих ксиланаз была обнаружена минорная целлюлазная активность [39, 70, 145, 146, 156]. Например, ксиланаза из Aspergillus niger IBT-90 обладает целлюлазной активностью, что является преимуществом при использовании этого фермента в пекарном деле [146]. Мажорная ксиланаза Fusarium oxysporum также проявляла целлюлазную активность (в 15-30 раз более слабую по сравнению с ксиланазной) [39]. Ксиланаза А. niger (28 кДа и р1 3,65) проявляла активность по отношению к карбоксиметилцеллюлозе, ара

. Все представленные в таблице 1,1 ферменты являются мономерами. Для некоторых ферментов с анализа была определена трехмерная помощью рентгеноструктурного структура [74, 107, 154, 166, 167]. Было показано, что ферменты, принадлежащие к обоим семействам, образуют компактную структуру с активным центом в виде щели. В результате анализа продуктов расщепления ксилана различными ксиланазами было высказано предположение, что ксиланазы 10-го семейства имеют каталитический центр меньшего размера,

1.2.6. Аминокислотные иоследовательиости грибиых ксиланаз и структуры кодирующих их геиов. Во многих работах приводится сравнение аминокислотных последовательпостей ксиланаз, производимых мицелиальными грибами [35, 40, 41, 80, 96-98, 115, 163, 167], Ферменты, принадлежащие к одному семейству обнаруживают высокую степень гомологии: более 50% совпадающих ами1юкислот для белков из организмов, принадлежащих к разным родам; при этом обнаруживаются области со 100% гомологией на протяжении 10 15 а

1.2.7. Посттрансляционная модификация ксиланаз. Являясь внеклеточным белком, ксиланазы синтезируются в виде пробелка, от которого отщепляется лидерный пептид, размер которого, обычно, составляет 20 - 25 аминокислот [6, 80, 131, 155, 177]. Как многие другие внеклеточные белки, ксиланазы могут быть Ои Nгликозилированы. Степень гликозилирования ферментов одного организма может сильно различаться. Например, для трех ксиланаз А. kawachii (XylA, XylB и XylC) степень гликозилирования составляе

1.3. Регуляция траискрииции генов ксиланаз мнцелиальиых грибов. Как уже упоминалось, при росте на питательных средах, содержащих растительные остатки производят целый в качестве источника углерода, многие грибы ферментов для гидролиза спектр внеклеточных полисахаридов, содержащихся в этих остатках. Подробное рассмотрение снектра ферментов, производимых грибами рода Aspergillus при росте на различных средах, проведено в [49], грибами рода Penicillium - в [35], грибами рода Trichoderma - в [2

3.2. Регуляторы транскрипции ксилаиазных генов Aspergillus XInR и СгеА. Изменение транскринции ксиланазных генов в ответ на изменение источников углерода в питательной среде у ряда грибов рода 33 Aspergillus осуществляется двумя регуляторными белками: XlnR и СгеА. Далее мы рассмотрим роль каждого белка. XlnR. Активация транскрипции ксиланолитических и целлюлолитических генов среде А. niger, в ответ на ноявление в питательной продуктом гена xlnR позитивным ксилозы, осуществляется регулятор

1.3.3. Координированная эксирессия арабиназных генов А. niger. Как упоминалось в главе

1.4.1, L-арабиноза и L-арабитол индуцируют синтез ферментов А. niger, гидролизующих арабинановые цени - двух a-L- арабинофуранозидаз, и одной эндо-арабиназы.

Введение дополнительных копий любого из генов, кодирующих a-L-арабинофуранозидазы в исходный штамм А. niger, приводило к резкому сокращению нродукции другой арабинофуранозидазы и эндо-арабиназы [68]. Этот факт был истолкован как указание н

. Продукция ксиланолитических ферментов грибами рода Trichoderma наиболее изучена у Т. reesei (Hypocrea jecorina). Ксиланазная активность наблюдается в культуральной жидкости этого гриба при росте па ксилане, целлюлозе, софорозе (дисахарид из двух Р-1,2связанных остатков глюкозы) и ксилобиозе, как на единственных источниках углерода [87, 121]. При росте на глюкозе синтез ксиланазы штаммами дикого тина практически не происходит, по он начинается при исчерпании глюкозы в среде [121]. D-кси

1.3.5. Регуляторы транскрипции ксилаиазиых генов Т. reesei. Идентифицировано четыре белка (Acel, Асе2, Xyrl и Crel), регулирующих транскрипцию ксиланолитических и целлюлолитических генов Т. reesei, в ответ на изменение источников углерода в питательной среде. Кроме того, в регуляции принимают участие белки Нар-комплекса (Нар2, НарЗ, Нар5), и идентифицирован сайт связывания неизвестного репрессора в промоторе хул2 [25, 27, 143, 181], Crel является структурным и функциональным гомологом Сг

1.3.9. Регуляция транскрипции геиов ксилаиаз в зависимости от рН среды. Транскрипцию генов Л. nidulans в ответ на изменение рН среды регулирует транскрипционный фактор РасС [164]. Этот белок становится активным при повышении рН среды, и активирует транскрипцию генов. 44 индуцируемую щелочными условиями, одновременно репрессируя транскрипцию генов, экспрессия которых происходит в кислых условиях. В некоторых работах отмечается зависимость продукции ксиланаз мицелиальными грибами от рН окру

. Р. canescens F178 - природный почвенный изолят, который был выделен как природный продуцент р-галактозидазы, и до настоящего времени используется для производства этого фермента [1]. Он характеризуется большой продукцией внеклеточного белка (до 5 г/л), больщая часть скоростью которого состоит из нескольких ферментов, высокой на недорогих ферментационных средах, низким его роста количеством секретируемых протеиназ. Все эти свойства делают перспективным биотехнологическим объектом. Некот

Реактивы, плаз1У1идныс вектора, ферменты и материалы. Рестрицирующие эндонуклеазы, Taq-полимераза, фрагмент Клёнова ДНКполимеразы IЕ. соИ - "Fermentas", Литва. Плазмидные вектора: pBluescript II SK - "Stratagene" США, pUC57 - "Fermentas", Литва. Нейлоновые мембраны для гибридизации нуклеиновых кислот: "Hybond-N", "Amersham", Англия. Стандартные прямой и обратный праймеры М13 - "Fermentas", Литва. Неорганические кислоты, уксусная ки

Общие методы. Выделение плазмидной ДНК, наращивание бактериофага X. и выделение его ДНК, рестрикция и электрофорез ДНК, проводили как указано в [9]. Нрепаративное наращивание бактериофага производили в конических 700 мл колбах со 100 мл среды NZYM, методике онисанной в [9]. но

Исследование ростовых характеристик грибов. Ростовые характеристики исследовали на чашках с минимальной агаризованной средой РМ [4]. Сахара добавляли в среду в количестве 10 г/л, ксилан и карбоксиметилцеллюлозу - в количестве 10 г/л. Способность к росту определяли уколом петлей с небольшим кусочком мицелия,

Электрофоретическое разделение разделеиие белков 0,1% проводили в белков. 10% Трис- Электрофоретическое полиакриламидном геле с добавлением SDS, используя глициновую буферную систему Лэммли [110], На одну дорожку наносили 10 мкл культуральной жидкости, Неред нанесением пробы денатурировали нагреванием в течении 3 минут в кипящей водяной бане в присутствии 1% SDS и 5% 2-меркаптоэтанола, Но окончании процесса гель фиксировали 30 минут в 50% ТХУ, окрашивали в 0,1% растворе кумаси голубого

Получеиие [а-32Р]-меченных фрагмеитов ДНК. В работе иснользовался набор для меченья ДНК "HexaLabeF'^ DNA Labeling Kit" "Fermentas", Литва, и [a-^¥

Выделение ДНК из грибиого мицелия. Препаративное по следующей выделение ДНК из грибного мицелия осуществлялось методике: 1, Споры гриба смывали с чащки, суспендировали в 100 мл минимальной среды (до концентрации 1x10^-5x10^ спор/мл), и растили 12-24 часа, 2, Мицелий отфильтровывали, промывали буфером фильтровальной бумаге. 1 и отжимали на Буфер 1: Tris НС1 рН 7,5 - 50 шМ (5 ml 1М на 100) EDTA 20 т М (4 ml

0.5М на 100) 3, 1 г мицелия растирали в ступке, замораживая в жидком

1. Выделение РНК из грибного мицелия. мицелий на отделяли бумажном от культуральной жидкости водой, Грибной фильтрованием фильтре, нромывали высушивали, отжимая на фильтровальной бумаге, и замораживали при-70°С. 2. В стерильную микропробирку нробирку насыпали стерильные стеклянные шарики диаметром 0,45-0,55 мм примерно до отметки 0,5 мл, добавляли 0,5 мл стерильного буфера STES и 0,5 мл смеси фенол-хлороформ [9]. Помещали пробирку в ледяную баню. Буфер STES: 0,5 М NaCl 0,2 М Tris НС1 р