Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04, 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71641

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

3.4.2 Тинирование мультилокусным секвенированием 4

4.1

4.2

4.3

4.4 5 6 7 8 Обсуждение Коллекция образцов ДНК клинических штаммов iV.gonorrAoeae Прямое белковое профилирование Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae Тинирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции.

Заключение Выводы Список литературы Приложение Список используемых сокращепий АМП - антимикробный нренарат ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

Введение Гонорея - одна из наиболее распространенных на сегодняшний день инфекций, передающихся половым путём, остается актуальной проблемой в области практического здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость гонореей в мире составляет около 60 миллионов случаев в год [1], В России этот показатель также остается на достаточно высоком уровне - около 100 случаев на 100 тысяч населения в год [2, 3]. По этой причине, как в Российской Федерации (РФ), так и

Общая характеристика Neisseria gonorrhoeae Гонококки, возбудители гонореи - инфекционного заболевания с гнойными воспалительными проявлениями в мочеполовых путях, были открыты Нейссером в 1879г., этиологическая роль доказана Буммом в 1885г., тогда как авторство термина «гонорея» нринисывают Галену (II век до н.э.) [7]. Согласно современным таксономическим нредставлениям возбудитель гонореи Neisseria gonorrhoeae отнесен к семейству Neisseriaceae, роду Neisseria, включающего ещё один патогенный

2 Гонококковая инфекция.

1.2.1 Основиые факторы иатогеииости и иатогеиез гоиореи N. gonorrhoeae имеют множество факторов иатогеииости, хотя и не продуцируют каких-либо экзотоксинов, к основным факторам патогенности относят капсулу, пили, ЛОС, белки внешней мембраны, железо- связывающий белок, IgA-протеазу. Как уже говорилось выше, бактерии свежевыделе1П1ых культур имеют капсулу, прямому которая проявляет антифагоцитарные контакту микробицидных субстанций свойства (препятствует стенкой, с клеточной маскирует ее ант

1.2.2 Эпидемиология Человек является единственной естественной средой обитания N. gonorrhoeae. Источник инфекции - больной человек. Диссеминированная гонококковая инфекция часто протекает бессимптомно и более характерна для женщин, часто в таких случаях лечение не проводится, что делает женщин основными носителями. Путь передачи - половой; возможно инфицирование плода при прохождении через родовые пути матери; также отмечены казуистические случаи заражения при несоблюдении элементарных прави

Высокая изменчивость и мозаичность антигенной структуры гонококков является до настоящего времени основной причиной неудачи в создании профилактической вакцины против гонореи. Общепризнанной и эффективной сегодня является терапия гонореи с применением антибиотика в однократной дозе, при условии, что микроорганизм чувствителен к данному антибактериальному препарату. N. gonorrhoeae, обладая выраженной пластичностью генома, снособпостью легко обмениваться генетической информацией как внутри вид

1.3 Внутривидовая вариабельность N. gonorrhoeae и гетерогенность нонуляцин

Для культуры N. gonorrhoeae характерен значительный морфологический полиморфизм. Известны 4 варианта колоний (Т1-Т4 или 14), впервые описанные Kellogg et al. [19, 20], которые отличались по способности отражать и преломлять свет при косом освещении в микроскопе. Кроме того, у гонококков 1 и 2 типов обнаруживаются пили (современное обозначение - Р"^ и Р^^), тогда как у штаммов 3 и 4 типов (Р") пили не выявлены [45, 46]. Показано, что морфологические особенности гонококка соотносятся

1.3.2 Физиологическая и серологическая гетерогеииость гонококков Хорошо известны отличия штаммов гонококка по потребности в некоторых элементах питания. Различают штаммы N. gonorrhoeae, требующие для своего роста присутствия аргинина (ауксотип А), пролина (ауксотип Р), аргинина, гиноксантина и урацила (ауксотип AHU), не требующие снециальных добавок (ауксотип NR) и прототрофные (Proto) или О - типы (нулевые). В целом выделено более 30 ауксотипов, наибольшую значимость из которых имеет ауксот

3 Фенотипическая устойчивость Проблема гетерогенность гонококков. Лекарственная возникновения устойчивости к антибиотикам сделала неизбежным привлечение для терапии гопореи новых препаратов и групп препаратов. В лечении гонореи использовались и/или используются различные представители следующих групп антибактериальных агентов: пенициллины, тетрациклины, макролиды, фторхинолоны, цефаллоснорины, спектиномицин. Ниже рассматриваются нринципы действия перечисленных классов антибиотиков к

3.1 Формирование устойчивости к различным классам антимикробных нрснаратов Тетрациклины и ненициллины занимают особое место среди АМП нренаратов в силу своего широкого распространения и доступности. Вместе с тем широкое распространение нолучает и устойчивость микроорганизмов к препаратам этих классов, механизмы формирования которой разнообразны и часто реализуются в одном штамме бактерии одновременно, что на фенотиническом уровне приводит к феномену мультирезистентности. Для штаммов, пр

3.2 Методы оценки лекарственной устойчивости возбудителя. Аиализ геиетических маркеров Первостепенное значение в мониторинге любого инфекционного заболевания имеет точная идентификация возбудителя и определение его профиля чувствительности к различным классам АМП (антибиотикограмма). Как уже говорилось выше, микробиологические методы определения чувствительности не являются рутинными тестами в диагностике гонореи. Однако, имеют неоспоримое значение при проведении мониторинговых исследований

4 Современные gonorrhoeae Как альтернатива A/S-типированию для характеристики и штаммовой дифференциации N. gonorrhoeae были предложены новые нодходы, как нравило, основанные на анализе изменчивости отдельных бактериального генома в целом. К таким подходам относятся амнлификация фрагментов генома с использованием случайных нраймеров (AP-PCR) [119, 120], анализ генов или нодходы к оценке гетерогенностн нонуляцнн Л'^ полиморфизма длин амплифицируемых фрагментов генома (AFLP) [121, 122]. Для оц

4.1 /7ог-типирова11ис Рог белок является структурным компонентом наружной мембраны гонококка и экспрессируется постоянно. Структура его антигенных детерминант остается неизменной у данного штамма, культивируемого in vitro, а значит, служит его уникальной характеристикой. Вместе с тем. Рог белок, играющий важную роль в процессах адгезии к эпителиоцитам и инвазии внутрь клеток и являющийся мишенью для антител, характеризуется ярко выраженной адаптивной изменчивостью. В геноме кодируется однок

4.3 Прямое белковое профилирование с иеиользованием MALDI-TOF масс-спектрометрии В современном ускоряющемся мире все более актуальными становятся быстрые ситуативные методы анализа. В том числе и современная микробиология, ее прикладные направления требуют быстрых и точных методов анализа, В свете проблем: быстро развивающейся и распространяющейся лекарственной устойчивости прессом широкого использования АМП), (нод массированным в условиях угрозы меняющейся глобализации биологического э

Бактериальные штаммы В работе использовали контрольный (АТСС 49226) и 464 клинических штамма Л'', gonorrhoeae, выделенных от больных неосложнённой гонореей, пациентов из 14 региональных центров РФ: Архангельска, Екатеринбурга, Иркутска, Калуги, Кирова, Москвы, Мурманска, Нижнего Новгорода, Нскова, Рязани, Санкт-Петербурга, Самары, Ставрополя, Чебоксар. Микробиологическая идентификация, выделение чистой культуры и оценка чувствительности к антибиотикам проводили в бактериологической лаборатори

Для проведения прямого масс-спектрометрического профилирования бактериальных белков использовали высеянную на шоколадный агар свежую 48-ми часовую культуру гонококка, находящуюся в стационарной фазе роста. В качестве референтного микроорганизма использовали лабораторный штамм Escherichia coli DH5a также в виде свежей 18-ти часовой культуры, выращенной на LB-arape по стандартной методике.

Экстракцию белков образца проводили путём добавления к материалу культуры бактерии (одиночная колония) 50 мкл смеси 2,5% трифторуксусная в кислота «AT» (50% (ТФУ)) и ацетонитрил (АЦН) / ресуспендирования. Полученный результате последующего центрифугирования (1 мин X 14000 об/мин) супернатант использовали в дальнейшем для анализа.

2.2.3 Сокристализация матрицы и аиалита В качестве матричного (а-СНСА, соединения использовали а-циано-4acid), гидроксициннамовую a-cyano-4-hydroxy cirmamic синапиновую (SA, sinapinic acid, 3,5-dimethoxi-4-hydroxy cinnamic acid) и феруловую (FA, ferulic acid) кислоты в виде насыщенных в AT растворов. Все использованные реактивы, включая воду, были аналитической чистоты 55 И И специальные для масс-спектрометрии. Оптимальными были выбраны Л следующие процедуры сокристализации матрицы и обра

Масс-снектрометрический анализ проводили с использованием MALDI времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного азотным лазером (^=337 нм), использованная частота импульсов которого составляла 10 Гц. Все измерения проводили в линейной режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением -

20.0 кВ. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z от 2000 до 20000, используя напряжение на накапливающем электроде -

При интерпретации масс-спектров исходили из предположения, что большая часть регистрируемых пиков соответствует белковым молекулам, а определяемые массы - массам целых (не фрагментированных) белков. Идентификацию белков проводили путем поиска совпадения значений экспериментальных соответствующих масс базах с массами белков, аннотированных в данных (SwissProt/TrEMBL) с использованием ресурсов ExPASy-сервера (http://ca.expasy.org/srs5/). При вводе значения для параметра «MolWeight» использов

2. Выдсленне тотальной ДНК Л'^ gonorrhoeae Полученные в процессе культивирования на селективных питательных средах клетки N. gonorrhoeae использовали для выделения ДНК по методу Boom с соавторами (первичный лизис биомассы раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией и очисткой ДНК) [158].

2.3.2 Амнлнфикацня фрагментов генома N. gonorrhoeae Для амплификации генов N. gonorrhoeae, связанных с механизмами устойчивости к пенициллинам - Ыа, рог, ропА, репА; тетрациклинам - tet{M), rpsJ; макролидам - егтВ, ermF, те/А, rrl; фторхинолонам - gyrA, рагС, погМ; спектиномицину - rrs, эффлюкс ксенобиотиков и обеспечивающих гена mtrR и активный неспецифический его промоторной области использовали праймеры, приведенные в таблице 3 [139, 82, 83, 72, 159,14]. рог ген, размер которого колеблетс

2.3.3 Подготовка продуктов амплификации для дальпейшего апализа Для последующего проведения реакции секвенирования проводили дефосфорилирование концевых фосфатных групп дНТФ и элиминацию оставшихся праймеров в пост-амлификационной смеси. Для этого инкубировали образцы с 1 единицей активности антарктической фосфатазы (New England BioLabs, Великобритания) и 5 единицами активности экзонуклеазы I (Fermentas, Евросоюз) при 37°С в течение 30 минут с последующей инактивацией ферментов прогреванием

2.3.4 Минисеквепироваиие и масс-спсктрометричсский аиализ иродуктов реакции Проведение реакции минисеквенировапия Для идентификации точечных однонуклеотидных полиморфизмов в генах N. gonorrhoeae, ответственных за формирование лекарственной устойчивости, использовали метод минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов амплификации. Реакцию термоциклического минисеквенирования проводили в 10 мкл реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCl рН

9.0;

16.6 мМ (N

2.3.6 Анализ пуклеотидпых последовательностей генов рог, рагС, «домашнего хозяйства» Восстановление полноразмерных последовательностей рог гена, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI®

9.0» (Informax, Inc). Для расчёта параметров (количество гетерогенности анализируемых последовательностей полиморфных сайтов, число аллелей, нуклеотидное разнообразие), теста

Прямое белковое профилирование штаммов iV. gonorrhoeae Цельные бактериальные клетки культуры N. gonorrhoeae подвергали прямому белковому анализу с использованием MALDI-TOF масс- спектрометрии. Для этого на первом этапе с использованием лабораторного штамма Е. coli DH5a отработали методики получения белкового экстракта и масс-спектрометрического анализа, с целью получения воспроизводимых и максимально насыщенных масс-спектров. При выборе оптимального протокола лизат клеток Е. coli DH5a в рас

Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae На основании анализа большого числа современных литературных данных резюмирована информация о генетических механизмах формирования устойчивости гонококка к различным классам АМП. Осуществлен дизайн праймеров для реакций амплификации (частично использованы ранее предложенные последовательности праймеров [14, 72, 82, 83, 139, 159]), минисеквенирования и секвенирования 15 генетических локусов, изменения которых ассоциир