На сайте проводятся работы. Работоспособность будет восстановлена к 12:00 3 июля

Низкая цена
Всего 249a за скачивание одной диссертации
Скидки
75 диссертаций за 4900a по акции. Подробнее
О проекте

Электронная библиотека диссертаций — нашли диссертацию, посмотрели оглавление или любые страницы за 3 рубля за страницу, пополнили баланс и скачали диссертацию.

Я впервые на сайте

Отзывы о нас

Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов : диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.03

Год: 2006

Номер работы: 71635

Автор:

Стоимость работы: 249 e

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Оглавление и несколько страниц
Бесплатно

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Читать онлайн
постранично
Платно

Просмотр 1 страницы = 3 руб



Оглавление диссертации:

ВВЕДЕНИЕ Достигнутый в последние десятилетия стремительный прогресс биотехнологии, в частности, микробиологического производства промышле1Н1ых ферментов сделал бациллы одним из наиболее значимых для человека объектов живой природы, поставив их в один ряд с сельскохозяйственными животными и растениями, пекарскими дрожжами, мицелиальными грибами и актиномицетами. Иллюстрируя экономическую значимость бацилл, достаточно сказать, что объем мирового производства только препаратов а-амилазы, синтези

Введение Одной из общих черт прокариотических и эукариотических клеток является транспорт белков из места их синтеза, в основном цитоплазмы, в другие пункты назначения как внутри, так и снаружи клетки. Для достижения этого экспортируемые белки обычно синтезируются в виде предшественников с N-копцевым сигнальным пептидом, который распознается клеточными 1998). сортирующими Сигнальные и транслоцирующими пептиды представляют белки собой системами короткие (von Heijne, 1990; последовател

Большинство белков, которые транспортируются через цитоплазматическую мембрану любой клетки, синтезируются с N-концевым сигнальным пептидом, или секреторным лидером. Поскольку В. subtilis, как и другие грам-положительные бактерии, не имеет внешней мембраны, многие из этих белков секретируются непосредственно во внешнюю среду. Наиболее массовые секретируемые белки представляют собой ферменты, гидролизующие природные полимеры; протеазы, липазы, гликозидазы, ДНКазы и РНКазы. Эти деградирующие п

2.3. Струюгура сигнального нептнда в целом И в нрокариотических, и в эукариотических клетках белки, транспортируемые через мембрану, обычно содержат особую N-концевую последовательность, называемую сигнальным, или лидерным, пептидом, который играет ключевую роль в определении пути белка для транслокации через мембрану. Его физическими свойствами определяются взаимодействия между экспортируемым белком, липидами мембраны и белками транслокационного пути. Хотя нервичная структура N-концевых си

2.4. Классификация сигнальных нептндов В настоящее время на основании имеющихся данных по распознаванию СПазами специфических последовательностей можно выделить четыре класса N-концевых 15 сигнальных пептидов. Первый главный класс образован «типичными» лидерными нептидами, которые присутствуют в пре-белках и отщепляются различными СПазами В. subtilis типа1 (Tjalsmae/. Й/., 1997; 1998; 1999b). Хотя большинство белков с подобными сигнальными пептидами, по-видимому, секретируются во внешнюю сред

2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся через главный секреторный нуть (Sec-систему) Идентификация сигнальных пептидов с помощью компьютерных алгоритмов выявила 180 поте1щиальных субстратов для СПаз типа1. RR-мотив, содержащий как минимум три остатка в консепсусной последовательности R-R-X-#-# (где #- это остаток гидрофобной аминокислоты) (Cristobal et. al, 1999) был найден в 14 случаях из этих 180. На этом основании предполагается, что соответствующие пре-белки могут транспорти

2.4.4. Сигнальные пептиды липопротсинов Поскольку сигнальные пептиды линопротеинов в среднем короче, чем пре-пептиды секреторных белков, не все липопротеины распознаются SignalP алгоритмом (NielseneA д/., 1997). Кроме того, некоторые липопротеины, например, CtaC (номер 17 в таблице 4), содержат несколько трансмембранных доменов, и поэтому исключались из предсказания сигнальных пептидов, как описано выше. Таким образом, сигнальные пептиды предполагаемых липопротеинов выявляли путем поиска их

2.4.5. Сигнальные пептиды препилин-подобных белков Только четыре белка, необходимые для связывания ДНК и поглощения ее клеткой в состоянии компетентности (ComGC, ComGE, ComGD, ComGG), которые, как уже и было известно, содержат сигнальные пептиды IV типа (препилин-подобные; препилин-подобные Chung е?. д/., 1998), были идентифицированы как несущие сигнальные последовательности у белков В. subtilis с использованием алгоритмов SignalP и Blast (Таблица 6). Поскольку препилиновая СПаза (СошС) д

2.4.6. Сигнальные нсптиды бактериоцииов и феромонов Бактериоцины и феромоны (кроме белков PhrA-PhrK) с отщепляемым N-концевым сигнальным пептидом образуют отдельную группу экспортируемых белков, которые переносятся через АВС-трапспортную систему (ATP-binding cassette, АТР-связывающую кассету). Сигнальные пептиды этого класса секреторных белков не могут быть определены обычными алгоритмами (типа SignalP) для предсказания лидерных пептидов, поскольку они состоят только из N- и С-доменов и не и

С использованием комньютерных программ для предсказания сигнальных пептидов можно оценить, какой процент протеомы транспортируется в различные компартменты. Примерно около 75% протеомы В. subtilis не имеют N-концевых сигнальных пептидов или мембранных сегментов, и большинство соответствующих белков, вероятно, локализованы в цитоплазме клетки. Белки с N-концевыми сигнальными пептидами (предположенными), около 7%, или трансмембранными сегментами (около 18%), по-видимому, направляются к цитоплаз

Различные компоненты Sec-завнсимой секреторной системы можно объединить в шесть групп: цитозольные шанероны, двигатель транслокации (SecA), компоненты транслокационного канала (SecYEG и SecDF-YajC), СПазы, ПСПазы и, наконец, факторы фолдинга, функционирующие на внешней (транс) стороне мембраны. Главные компоненты данной секреторной системы В. subtilis показаны на Рис. 5 и перечислены в Таблице 7. Кроме того, в таблице 7 перечислены гомологичные и/или аналогичные компоненты из Е. соИ, архебакт

2.6.1. Цитозольные шапсроиы Большинство белков, направляемых на экспорт, могут переноситься через мембрану в более или менее денатурированной форме, что позволяет им проходить через транслокационный канал Sec-системы. Для облегчения этого процесса цитозольные факторы поддерживают транспортируемые пре-белки в так называемом транслокационно-компетентном состоянии. Такие факторы, называемые шаперонами, связываются с нре-белками и предотвращают их фолдинг и агрегацию. Некоторые из этих щаперонов

1.1. Шапероиы, специфически участвующие в секреции. У В. subtilis единственным идентифицированным к настоящему времени шапероном, специфичным к секреторным белкам, является белок Ffh (fifty-four homologue), ГТФаза, гомологичная 54-кДа субъединице эукариотической сигнал-распознающей частицы (Srp54, signal recognition particle) (Honda еГ. al, 1993). Этот белок образует комплекс (обозначаемый SRP) с малой цитоплазматической РНК (scRNA, мцРНК), которая функционально сходна с эукариотической 7S РН

6.1.2. Шапсропы широкого спектра действия. В дополнение к специфическим косекреторным шаперонам в транслокации белков могут принимать участие и шапероны общего назначения, обеспечивая баланс между процессами денатурации и фолдинга белков. (Lill et. al., 1988) были первыми, кто продемонстрировал, что так называемый триггерный фактор (TF, trigger factor) является цитозольным белком, связанным с рибосомой, который может in vitro поддерживать предшественник белка внещней мембраны про-ОтрА в транс

2. Трапслоказа Sec-система транслокации пре-белков у Е..соН представлена как минимум семью белками: SecA, который является главным двигателем транслокации, и интегральными мембранными белками SecD, SecE, SecF, SecG, SecY и YajC. Гомологичные всем перечисленным компонентам белки были найдены п у В. subtilis. В разработанной на настоящий момент модели транслокации пре-белков, основанной на результатах исследований, полученных главным образом на Е. соН, предполагается смена нескольких носледова

2.6.3. Сигнальные псптидазы типа I Сигнальные пептидазы (СПазы) отщепляют сигнальный пептид от секреторных пре-белков в тот момент, когда С-конец секреторного лидера появляется на внещней стороне цитоплазматической мембраны. Эта реакция является необходимым условием для освобождения зрелого секреторного белка с мембраны. Одной из наиболее интересных особенностей системы секреции белков у В. subtilis является присутствие множестве!Н1ЫХ наралогичных СПаз типа I, в противоположность ситуации во

2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой тииа II В отличие от СПаз типа I, В. subtilis имеет только один ген для СПазы И типа (ген isp) (Tjalsmae/. al., 1999а), продукт которого Lsp необходим для специфического процессинга модифицированных липидами пре-белков. Известные СПазы этого тира являются интегральными мембранными белками с четырьмя (предположительно) трансмембранными сегментами, причем их Nи С-концевые области предположительно экспонированы в цитозоль (Tjalsmaer. о/., 1999с). Потенциал

После отщепления от пре-белков сигнальные пептиды быстро деградируют. Было показано, что сигнальный пептид главного линопротеина Е. coli (Lpp, называемого также липопротеипом Брауна) деградирует с участием связанной с мембраной протеиназы IV SppA (которую также называют пептндазой сигпального пептида, или ПСПазой; кодируется она vmousppA). Однако и в отсутствие протеиназы IV наблюдается деградация сигнальных пептидов, что говорит о способности других протеиназ заменять протеиназу IV в этом п

2.6.6. Внецитоплазматические катализаторы фолдиига белков После того, как секреторные белки прощли через канал транслокации, они должны Припять свою нативную конформацию на внещней (транс-) стороне мембраны. Правильный н быстрый фолдинг является необходимым условием их существования, так как частично и полностью денатурированные белки весьма чувствительны к действию нротеиназ, которые, как правило, присутствуют в этом новом для них окружении. Это подтверждается такими наблюдениями, например,

6.1. Пептидил-пролил цис-траис изомеразы. Одним из белков, участвующих в фолдинге транслоцированных белков, является PrsA, - липопротеип, заякоренный с внешней стороны цитоплазматической мембраны (Kontinen and Sarvas, 1993). На основании сходства последовательностей было предположено, что PrsA является ППИазой (PPIase, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase), припадлежащей к семейству парвулина (PpiC). PrsA оказался важным для жизнеспособности клетки, и было показано, что штаммы, содерж

6.2. Тиол-дисульфид оксндоредуктазы. Дисульфидные связи важны для активности и стабильности многих белков. Дисульфидные связи образуются in vitro снонтанно, но этот нроцесс идет гораздо медленнее и менее эффективно, чем in vivo, где образование дисульфидных связей катализируется тиол-дисульфид оксидоредуктазами. У Е. соИ дисульфидные связи формируются в нериплазме, где обнаружено шесть комнонентов, участвующих в этом процессе; DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, DsbE и DsbG (Andersen et. al, 1997). Бело

. Пропептид, часто присутствующий у секреторных белков рода Bacillus,- это последовательность аминокислотных остатков, расположенная между сигнальным нептидом и зрелой частью белка. У В. subtilis их длина варьирует от восьми аминокислотных остатков (а-амилаза) до 194 остатков (нейтральная протеиназа NprE). Хотя функция коротких пропептидов пока абсолютно не ясна, длинным пропептидам, которые обнаруживаются в основном у протеиназ, приписываются как минимум две важные функции. Во-первых, считае

6.4. Другие катализаторы фолднцга (небелковой природы). Некоторым секреторным белкам для фолдинга необходимо присутствие в среде катионов, таких как Fe^* и Са^'^. Секреция левансахаразы В. subtilis стимулируется при выращивании клеток на среде, содержащей высокие концентрации Fe^*, и этот катион значительно улучщает фолдинг денатурированной левансахаразы В. subtilis in vitro, хотя Fe и не связан со зрелым белком (Tjalsma et. al, 2000). Более того, некоторые внеклеточные белки В. subtilis, та

Виды рода Bacillus являются коммерчески важными продуцентами осповпых промышленных ферментов. Высокое качество этих белков достигается, хотя бы частично, благодаря наличию в клетке систем контроля качества, которые способны эффективно удалять неправильно свернутые или неполностью синтезированные белки. Как ни парадоксально, эти системы для контроля качества представляют собой главные «узкие места» для секреции многих гетерологичных белков в промышленных количествах, поскольку фолдинг таких бе

2.8.1. Tat-спстема транспорта Как и другие эубактерии, В. subtilis, по-видимому, имеет недавно открытую Sec-независимую систему транснорта белков, известную как Tat-система. Этот путь транспорта впервые был открыт в хлоронластах, где он служит для АрН-зависимого импорта белков в просвет тилакоидов (Settles et. al, 1997). Было показано, что в отличие от Sec-зависимой транслокации белки могут транспортироваться через эту систему в нативной третичной конформации (Hynds et. al., 1998). Далее, был

2.8.2. Система экспорта прспилин-иодобиых белков Следующий класс белков В. subtilis, которые экспортируются Sec-независимым способом, представлен пилин-подобными белками IV типа, которые кодируются генами cowGC, comGD, comGE и comGG. Соответствующие генные продукты участвуют в развитии генетической компетентности клеток. Они имеют сходство с пилинами типа IV различных грам-отрицательных эубактерий, которые синтезируются в виде предшественников с сигнальными пептидами, которые впоследствии о

Определенные виды Bacillus продуцируют пептидные антибиотики, которые могут синтезироваться как с участием рибосом, так и ферментативно. Некоторые синтезируемые рибосомами пептидные антибнотики имеют сигнальные пептиды для транслокации через мембрану с участием АВС-транспортеров (Havarstein et. al, 1995). Было показано, что у В. subtilis ХЬЪ опероп sunS-sunT кодирует, соответственно, лантибиотик субланцин 168 и АВС-транспортер SunT, необходимый для образования субланцина (PaikeA а/., 1998). З

2.9. Роль пропептида в секрецпп белков На примере двух Zn-связывающих металлоэпдопептидаз грам-отрицательного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa: эластазы и протеиназы LasA, - впервые была изучена роль пропептида секреторных бактериальных нротеиназ в их транслокации через цитоплазматическую мембрану (Kesslere^ о/., 1998). Первое доказательство существенной роли пронентида в секреции было получено для эластазы при ее экспрессии в отсутствие нропептида в штамме Р. aeruginosa, несущем делецию

Клеточная стенка В. subtilis представляет собой компартмент клетки, в котором находится примерно 9% белков от общего их содержания (аналогично периплазме грамотрицательных бактерий) (Pooleye/. а/., 1996). Среди белков, удерживаемых клеточ1юй стенкой В. subtilis, присутствуют ДНКазы, РНКазы, протеиназы, ферменты, синтезирующие пептидогликан (пенициллин-связывающие белки), и гидролазы, которые принимают участие в образовании и гидролизе клеточной стенки во время роста и деления клеток, споруляц

Определенные ферменты В. subtilis, участвующие в поддержании целостности клеточной стенки и ее образовании, содержат в молекуле различное число повторяющихся аффинных к компонентам стенки доменов (Margote^. а/., 1998). Считается, что эти повторы направляют данные ферменты в специфические места, в которых происходит синтез и/или гидролиз клеточной стенки, как это было показано для Staphyllococcus aureus (Baba and Schneewind, 1998), Наиболее вероятно, такому специфическому направлению белков

2.10.2. Белки, ковалеитно связываииые с клеточной стенкой Белки из другой группы, располагающиеся на поверхности грам-положительных организмов, ковалентно присоединяются к клеточной стенке через С-конец. N-концевые домены молекул этих белков выставлены на поверхности клетки (Schneewind е/. а/., 1995). Для заякоривания поверхностных белков у S. aureus необходимо, кроме N-концевого сигнального нептида, наличие сигнала сортинга, состоящего из так называемого LPxTG-мотива, С-концевого гидрофоб

В ответ на недостаток пищевых ресурсов клетки В. subtilis образуют эндоспоры, способные выдерживать суровые условия, например, крайне низкие и высокие температуры (Stragier and Losick, 1996). В начале процесса споруляции образуется асимметрично расположенная перегородка, разделяющая клетку на два неравных по размеру компартмента. Далее больщий компартмент (материнская клетка) поглощает меньший компартмент (проспору), который, в конечном счете, становится спорой. Таким образом, нроспора окруже

2.11.1. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции. Одним из процессов, для которых необходим транспорт белков во время споруляции, является обмен информацией между материнской клеткой и проспорои. Было показано, что два белка экспортируются из просноры и взаимодействуют с мембранными белками материнской клетки. Первый белок, SpoIIR, синтезируется нроспорой еще до ее поглощения материнской клеткой. Предщественник этого белка несет функциональный сигнальный пептид, направляющий его

3.1.1. Стандартные растворы Буфер А: 50 мМ трис-НС1 рН

7.2, содержащий 1 мМ СаСЬ. PBS:

8.0 г/л NaCl;

0.2 г/л КС1;

1.15 г/л Na2HPO4;

0.2 г/л КН2РО4, рН

7.2. ТВЕ 20": 216 г/л трис-ОН;

111.3 г/л Н3ВО3;

18.6 г/л ЭДТА; НгО до 1 литра. PEG-6000 (Sigma) 30%-иый на 1%-иой сахарозе для трансформации L-форм.

3.1.2. Ферментные нренараты Рестриктазы и буферы для проведения рестрикции, ДНК-лигаза фагаТ4 были получены от фирм Boehringer Mann

3.2.1. Выделение плазмндпой ДНК по модифицированному методу Бирнбойма-Долли Для выделения ДНК культуру клеток выращивали в 3 мл в течении 15 часов при 37°С при иитенсивной аэрации. Клетки осаждали центрифугированием на настольной центрифуге (5000 об/мин, 20 сек.), промывали раствором А и инкубировали в 100 мкл того же раствора в присутствии 100мкг/мл лизоцима. Денатурацию проводили добавлением 200 мкл раствора В, состоящего из 200 т М NaOH и 1% SDS в течение 1-2 мин. Ренатурацию проводили на

3.2.2. Проведение нолнмеразной ценной реакцнн (ПЦР) Олигонукпеотидные праймеры Праймеры, использованные в дан1юй работе для конструирования гибридных модифицированных генов gseBL (Svendsen and Breddam, 1992) и cpt (Smulevitche/. a/., 1991), синтезированы и предоставлены нам лабораторией анализа генома Института Молекулярной Биотехнологии (Германия, Йена, зав. проф. Шлотт) или ЗАО «Синтол» (Москва). Таблица 9. Праймеры, использованные в работе. Название пранмера Нуклеотндная носледовательнос

3.2.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозиого геля методом Gene clean После проведения электрофореза вырезали агарозный блок, содержащий необходимый фрагмент ДНК, измеряли его объем. Вырезанный блок растворяли добавлением троекратного объема 6М Nal при температуре 65°С в течение 3-10 мин. К раствору добавлялось 2-3 мкл суспензии Glass milk (Bio-101). В течение 10 мин проводили адсорбцию ДНК из раствора. Glass milk с адсорбированной ДНК осаждали центрифугированием в течение 15 сек при 5000 об/м

Клетки L-форм выращивали в течение 16-18 часов на среде FB с добавкой 1% сахарозы и

0.5% дрожжевого экстракта при 37°С или на среде BHI с теми же добавками. Проводился микроскопический контроль качества культуры: в активной фазе роста она состоит из клеток диаметром не более

0.3-1 мкм и не содержит лизированных клеток. К 100 мкл культуры добавляли 5-10 мкг ДНК в объеме 5-10 мкл, и 150 мкл 30%-ного PEG-6000 (Sigma), приготовлеьпюго на 1% сахарозе. 10 мин клетки инкубировали на ледя

3.2.5. Адантация культур L-форм к росту в жндкой среде С чашки с выросшими L-формами с помощью стерильного шпателя вырезали агаровый блок объемом 1-2 мл и помешали в 30 мл жидкой среды FB, содержащей селектирующий аитибиотик. Клетки выращивались в течение 18-30 часов при умереиной аэрации при 37°С. Далее проводилось 5-30 пассажей выросших клеток L-форм в новые порции среды FB, при этом при первых пассажах в качестве ииокулюма вносилась 1/3-1/4 часть от объема жидкой среды, затем, по мере адап

3.2.7. Анализ экспрессии рекомбинаитных генов gseBL и cpt в клетках L-форм Р. mirabilis В ходе ферментации проводили анализ культур с целью обнаружения продуктов экспрессии гетерологичных генов. Для этого отбирали образцы по 500 мкл, клетки осаждали центрифугированием и каждую фракцию анализировали SDS-электрофорезом в ПААГ с последующим переносом на PVDF мембрану и иммуноферментным анализом. Полученные реплики проявляли специфическими антителами в разведении 1:200, антивидовым конъюгатом со

3.2.8. SDS-электрофорсз в ПААГ Растворы: Буфер концентрирующего геля (4х): 500 мМ трис-НС1, рН

6.8, содержащий

0.4% додецилсульфат натрия (SDS). 2. Буфер разделяющего геля (4х):

1.5 М трис-НС1, рН

8.8, содержащий

0.4% SDS. 3. Электродный буфер: 25 мМ трис-НС1,

0.2 М глицин,

0.1% SDS. 4. Денатурирующий буфер для нриготовления образцов: 8 М мочевина, 10 мМ DTT, 1% SDS, бромфеноловый синий. Конечная концентрация акриламнда в концентрирующем геле 6%, в ра

3.2.9. Иммунофермеитпый анализ методом Вестери-блоттипга Разделенные в ПААГ белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры или иммобилон Р (мембрана PVDF) методом полусухого электроблоттинга с помощью аппарата Novablot (LKB, Швеция) согласно инструкции изготовителя. Полученные фильтры обрабатывали в течение 2-14 часов

0.1% раствором желатина в буфере PBS, содержащем

0.3% Tween-20 с целью блокирования неспецифического связывания. Обработку специфическими кроличьими антителами проводи

3.2.11. Определение активности глутамплэндопептидазы GseBL 250 мкл буфера А, 5 мкл 20 мМ раствора Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA в ДМСО и 200 мкл ферментсодержащей фракции, элюированной с бацитрацин-сефарозы, инкубируются при 37°С до появления желтого окрашивания, свидетельствующего об отщеплении пара-нитроанилина. Остановка реакции производится добавлением 250 мкл 1 М Na-цитратного буфера рН

3.0, содержащего 20% ДМФА. Далее измеряется оптическая плотность раствора при длине волны 410 нм. За еди

3.2.12. Определение активности карбоксипснтидазы Т Для определения активности СрТ использовали пептидный хромофорный субстрат Dnp-Ala-Ala-ArgOH, синтезированный в нащей лаборатории. 200 мкл водного раствора субстрата с концентрацией

0.5 мг/мл, 200 мкл 50 мМ трис-НС1 буфера рН

7.2, содержащего I мМ СаСЬ, и 5-50 мкл раствора фермента инкубировали при 37°С в течение 5-30 мин. Реакцию останавливали добавлением 40 мкл 50%-ной уксусной кислоты. Дальнейшие измерения и вычисления активнос

Лиофилизованный пренарат культуральной жидкости L-форм Р. mirabilis растворяли в буфере А в концентрации 50 мг/мл, Нерастворившийся остаток удаляли центрифугированием и методом иммуноферментного анализа, используя в качестве контроля очищенный зрелый фермент GseBL с известной концентрацией, определяли количественное содержание в лиофилизованном нрепарате предшественника GseBL. Оказалось, что 100 мг лиофилизованного препарата содержат приблизительно 10 мкг рекомбинантного нрофермента. 100 мг п

3.2.14. Выделение предшественника GseBL из культуральпой жидкости L-форм 1 г лиофилизованного препарата культуральной жидкости L-форм, содержащего 100 мкг предшественника GseBL, растворили в 100 мл буфера А. Для активации предшественника к полученному раствору добавили металлонротеиназу В. megaterium, так чтобы соотношение предшественник:активируюший фермент составляло 10:1. Реакционную смесь инкубировали

1.5 часа при37°С при постоянном перемешивании, после чего останавливали реакцию сп

3.2.15. Выделение СрТ из культуралыюй жидкости L-форм Р. mirabilis Культуральную жидкость L-форм Р. mirabilis, содержащую секреторную форму СрТ, осадили сульфатом аммония, медленно, при постоянном перемещивании прибавляя его до концентрации в растворе 80%. Дали осадку сформироваться на холоде и отделили центрифугированием при 20 тыс. G. 1 г осадка, содержащего 10 мг СрТ, растворяли в 10 мл буфера состава 50 мМ трис-НС1 буфера рН

7.2, lMMCaCb и диализовали против этого буфера в течение 5

3.2.16. Процессинг секреторной формы СрТ ш vitro Фракцию, полученную после элюции с иммуносорбента, диализовали против 50 мМ трнс-НС1 буфера рН

7.2, содержащего 1 мМ СаСЬ. Концентрацию фермента в полученном после диализа растворе определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Отбирали аликвоты по 500 мкл, содержащие

0.1-

0.2 мг СрТ, и добавляли рассчитаьнюе количество термолизина или трипсина так, чтобы соотнощение активирующий ферментхекреторная форма СрТ составля